精氨酸缺陷型菌株發酵生產反式-4-羥脯氨酸

王曉姣，張震宇，孫付保，于林

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

精氨酸缺陷型菌株發酵生產反式-4-羥脯氨酸

王曉姣，張震宇*，孫付保*，于林

(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

為了獲得高產反式-4-羥脯氨酸的菌株，基于大腸桿菌的代謝網絡模型的指導，以大腸桿菌E.coliBL21(DE3)ΔputA為出發菌株，通過基因敲除技術成功敲除argB基因，阻斷L-脯氨酸合成的前體物L-谷氨酸的分支代謝途徑，增加L-脯氨酸合成的代謝流，構建了精氨酸缺陷型菌株E.coliBL21(DE3)ΔputAΔargB。同時轉入表達質粒pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp，該質粒含有突變基因proB2，該突變基因所編碼的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反饋抑制作用顯著降低。搖瓶發酵結果表明，在外源添加600 mg/LL-精氨酸時，該重組菌株產反式-4-羥脯氨酸的量達到312.67 mg/L，較菌株E.coliBL21(DE3)ΔputA/pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。

大腸桿菌1；反式-4-羥脯氨酸2；基因敲除3；脯氨酸4

反式-4-羥脯氨酸(trans-4-hydroxyproline，Hyp)為亞氨基酸，是L-脯氨酸經反式-4-羥化酶(proline-4-hydroxylase,hyp) 羥基化的產物，歸屬高附加值小品種氨基酸類[1]。Hyp在食品營養、化工生產、護膚美容業以及醫藥保健具有廣泛的應用[2-3]。由于其潛在的醫藥、食品價值以及市場需求，促進了反式-4-羥脯氨酸的研究步伐。

脯氨酸作為羥脯氨酸合成的底物，前期實驗室生產合成羥脯氨酸都需要外源添加脯氨酸[4-5]。脯氨酸的添加不僅導致生物法合成羥脯氨酸的成本大大提高，而且外源添加的脯氨酸大部分并不能被微生物所利用，造成了資源的浪費。

基于對代謝調節的認識，可以在基因水平和酶學水平上對Hyp的合成途徑進行理性操作。目的產物的積累一般有2種方式，積累關鍵前體和降低副產物生成：L-谷氨酸是L-脯氨酸生物合成的前體物質，同時也是L-精氨酸、L-鳥氨酸和L-瓜氨酸生物合成的前體物質，其胞內濃度決定了L-脯氨酸的合成速率[6]。因此，削弱競爭代謝途徑，阻斷L-谷氨酸到L-精氨酸的合成代謝流，使得L-谷氨酸到L-脯氨酸合成分支代謝流量增強，使得碳源、氮源等更多的用于脯氨酸的合成，可以提高L-脯氨酸的產量[7]。谷氨酸是脯氨酸和精氨酸的共同前體物(圖1)。為提高脯氨酸的產量可以采用基因敲除等方法切斷谷氨酸合成精氨酸的途徑，從而為脯氨酸的生產提供更多的原料。N-乙酰谷氨酸激酶(N-Acetylglutamate kinase EC 7 2.8，NAGK)，是精氨酸合成途徑的第2個酶。該酶由argB基因編碼，是精氨酸途徑中的關鍵酶。該酶不僅被精氨酸反饋抑制而且也被其反饋阻遏[8-9]，而且是精氨酸生產過程中被精氨酸抑制的唯一限速酶。本文選擇敲除精氨酸代謝途徑中的argB基因，切斷精氨酸代謝途徑，使得脯氨酸大量積累，從而獲得羥脯氨酸高產菌株。

圖1 大腸桿菌中反式-4-羥脯氨酸生物合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathways of Hyp in E. coli

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

本實驗用到的菌株[5]及質粒[10]見表1，其中E.coliBL21(DE3)作為宿主，質粒pUC19作為基因表達載體。

表1 實驗所用菌株和質粒

1.1.2 試劑及儀器

葡萄糖、NaCl、MgSO4、K2HPO4、(NH4)2SO4、瓊脂粉、CaCl2、FeSO4、正丙醇、氯胺T、高氯酸、對二甲氨基苯甲醛、異丙醇、NH4Cl等購自上海國藥。胰蛋白胨、酵母抽提物、瓊脂糖、氨芐青霉素鈉、硫酸卡那霉素、氯霉素、TaqDNA聚合酶、PfuDNA 聚合酶、dNTP Mixture、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒等購自生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA限制性內切酶，DNA Marker，購自寶生物公司(中國，大連)。

主要儀器包括培養箱、恒溫搖床、分光光度計、電轉儀、PCR儀、電泳儀、冷凍離心機、氨基酸分析儀等。

1.1.3 培養基及培養條件

LB培養基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，調pH至 7.0～7.2。固體培養基另加1.5%的瓊脂粉。)用于培養E.coliBL21(DE3)。培養溫度37 ℃。發酵培養基(葡萄糖10 g/L，甘油5 g/L，胰蛋白胨15 g/L，(NH4)2SO45 g/L，K2HPO43 g/L，FeSO43 mmol/L，MgSO40.2 g/L，CaCl20.015 g/L)用于反式-4-羥脯氨酸發酵，用NaOH調節 pH 至8.0，250 mL三角錐形瓶分裝30 mL。菌株E.coliBL21(DE3)ΔputA/pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp發酵生產時，需要添加6～10 g/LL-脯氨酸；E.coliBL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp初步發酵添加1 g/LL-精氨酸。

抗生素的工作質量濃度:氨芐青霉素50 μg/mL，卡那霉素50 μg/mL，氯霉素50 μg/mL。

1.1.4 引物設計

本實驗所用引物序列見表2，由上海生工合成。

表2 實驗所用引物

注：下劃線部分是質粒pKD4的抗性基因序列。

1.2 重組大腸桿菌的構建

1.2.1 敲除基因argB獲得精氨酸缺陷型菌株

利用Red/ET同源重組系統[11-13]進行基因敲除(圖2)。

H2, H1是同源臂;P1, P2是抗性基因序列圖2 利用Red/ET同源重組系統進行基因敲除的過程Fig.2 Processes of gene knockout using the plasmid-assistant Red homologous recombination

以輔助質粒pKD4為模板，利用引物P1、P2通過PCR擴增直接獲得含有目的基因上下游同源臂和kan基因的線性打靶片段；將表達Red重組酶的輔助質粒pKD46導入E.coliBL21(DE3)ΔputA感受態細胞內，并制備為電轉感受態細胞(制備過程中需要添加L-阿拉伯糖以誘導質粒pKD46的Exo蛋白、Beta蛋白和Gam蛋白的表達)；將線性的打靶片段電轉導入電轉感受態細胞中以實現打靶片段與目的基因argB的配對重組(以kan基因片段替代目的基因argB)，之后采用42 ℃熱激耦合抗生素抗性負篩選的策略去除質粒pKD46；通過菌落PCR對在卡那抗性平板上篩到的單菌落進行驗證；將表達FLP重組酶的輔助質粒pCP20導入菌落PCR驗證正確的陽性轉化子中，FLP重組酶可以直接作用于兩個FRT位點并發生同源重組，去除2個FRT位點之間的kan基因片段以消除卡那抗性，并留下一個FRT“疤痕”[14]。

1.2.2 大腸桿菌電轉感受態制備方法

挑取含有pkD46的E.coliBL21(DE3)ΔputA單菌落接種于氨芐抗性的新鮮LB液體培養基中，30 ℃，220 r/min過夜培養；取過夜種子液按1%接種量接種到50 mL 氨芐抗性的新LB培養基中，并加入4.8 g/L的L-阿拉伯糖，30 ℃，220 r/min振蕩培養至OD600值達到0.5～0.6；將培養液分裝于滅菌的50 mL離心管中，冰上預冷 10 min，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，回收細胞；加入等體積的冰預冷10%(v/v)甘油重懸，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，重復甘油洗2次；小心棄去上清，利用殘留的甘油重懸細胞，每管分裝80 μL，-80 ℃保存。

1.2.3 大腸桿菌化轉感受態制備方法

接種大腸桿菌單菌落于50 mL pH 7.0的新鮮LB液體培養基中，30 ℃，220 r/min過夜培養；取過夜種子液按1%接種量接種到pH 7.0的新鮮LB培養基中，30 ℃，220 r/min振蕩培養(約2 h)至 OD600值達到0.5～0.6；將培養液分裝于滅菌的50 mL離心管中，冰上預冷 10 min；4 ℃，1 000×g 離心5 min，棄去上清，回收細胞；加入原培養液5%體積的TSB培養基充分懸浮菌體，緩慢吹打均勻；冰上放置10 min后分裝至已滅菌的1.5 mL離心管中，每管分裝50 μL，-80 ℃保存。

1.2.4 大腸桿菌感受態細胞的轉化方法(熱擊法)[4]

轉化體系為：30 μL ddH2O，10 μL 5×KCM(5 mol/L KCl，0.15 mol/L CaCl2，0.25 mol/L MgCl2)，10 μL重組質粒，10 μL感受態細胞。迅速混勻，先冰浴30 min；然后42 ℃熱擊90 s；接著冰浴5 min；最后加入600 μL新鮮的LB液體培養基，37 ℃ 220 r/min振蕩培養1 h；取100 μL復蘇培養后的菌液涂布于含抗生素的LB平板，于37 ℃恒溫培養箱中培養8～16 h。

1.3 發酵試驗

1.3.1 搖瓶發酵

將重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)ΔputAΔargB/ pUC19-BH在含有氨芐霉素的LB平板上劃線培養；挑取單菌落接種于含有50 μg/mL 氨芐的LB液體培養基中(30 mL/250 mL三角瓶)，37 ℃ 220 r/min振蕩培養8 h，作為種子液；按6%接種量取上述種子培養液1.8 mL接入發酵培養基(30 mL/250 mL三角瓶)，30 ℃ 220 r/min振蕩培養24 h。

1.3.2 生物量的測定

取發酵液，用去離子水稀釋相應倍數，并以去離子水為空白對照，測定600 nm波長處的吸光度值。

1.3.3 葡萄糖的測定

取1 mL發酵液，8 000 r/min 離心2 min，取200 μL上清液，加入200 μL DNS試劑，沸水浴5 min；用冷水冷卻樣品，然后加2.6 mL去離子水稀釋到3 mL，用分光光度計在540 nm波長處測定吸光度值。

1.3.4L-脯氨酸的含量測定

L-脯氨酸的檢測采用酸性茚三酮顯色法：將發酵液離心后，取上清，適當稀釋后取1 mL于10 mL試管中，加入1 mL冰乙酸；搖勻后加入1 mL酸性茚三酮；搖勻后沸水浴1 h；接著加入冰乙酸2 mL，搖勻后冷水冷卻，測定515 nm波長處的吸光度值。

1.3.5 反式-4-羥脯氨酸積累量的測定

反式-4-羥脯氨酸的檢測采用氯胺T法：將發酵液離心后，取上清，稀釋后取2.5 mL于10 mL試管中，加入1 mL氯胺T，搖勻后室溫放置20 min；然后加入1 mL顯色劑，搖勻后迅速將試管置于60 ℃水浴鍋中，20 min后取出冷水冷卻，用分光光度計在560 nm波長處測定吸光度值。

1.3.6 反式-4-羥化酶酶活的測定[15]

全細胞酶活測定條件：測定發酵液的OD600，根據大腸桿菌OD600和細胞干重的常用轉換計算公式，根據DCW(g/L) =0.54×OD600測得細胞干重DCW。發酵液12 000 r/min離心2 min后，棄掉上清液，回收菌體，將500 μL的酶反應緩沖液(MES 240 mmol/L(pH 6.5)，脯氨酸20 mmol/L，2-酮戊二酸40 mmol/L，硫酸亞鐵4 mmol/L，維生素C 8 mmol/L)加入到稱重好的菌體中，用酶反應緩沖液將細胞重新懸浮后，在35 ℃搖床中，220 r/mim培養15 min后，轉移到100 ℃水浴中加熱2 min終止酶反應，并測定反式-4-羥脯氨酸濃度，反式-4-羥脯氨酸的測定方法同上1.3.5。1個單位酶活定義1 min將1 nmol脯氨酸完全轉化為反式-4-羥脯氨酸的酶量，單位為U，全細胞酶活是每1 mg干菌體的酶活，單位為U/mg。

1.3.7 乙酰谷氨酸激酶活力測定[16]

2 mL反應總體積中，含0.1 mL 酶液，0.1 mL 0.2 mol/L鹽酸羥胺，0.28 mL 0.14 mol N-乙酰谷氨酸，0.2 mL 0.02 mol MgCl2，0.14 mL 0.014 mol ATP，1.18 mL 0.1 mol Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，37 ℃水浴保溫30 min，加2 mL FeCl3試劑(3.4%FeCl3溶于2 mol/L HCl，并與8%三氯乙酸等體積混勻)終止反應，測OD540值。1個酶活力單位(U)是指在上述條件下，反應體系中每分鐘催化1 μmol N-乙酰谷氨酸氧化所需的酶量。

1.3.8 氨基酸的測定

發酵液經12 000 r/min 離心5 min 后，取上清500 μL，加入500 μL 10%磺基水楊酸沉淀4 h，用0.02 mol/L HCl稀釋適當倍數，用0. 22 μm微孔膜過濾后，采用氨基酸分析儀 L-8900測定氨基酸。

2 結果與分析

2.1argB敲除菌株的驗證

經過抗性平板篩選，挑出只在非抗性平板上菌落，用驗證引物Y1、Y2進行菌落PCR，并進行核酸膠驗證。篩選到argB成功敲出的菌株。從圖3中可以看到出發菌株E.coliBL21(DE3)ΔputA菌落PCR得到片段大小為1 000 bp，與通過驗證引物Y1、Y2進行菌落PCR獲得的片段大小相當(片段大小為964 bp)；卡那片段成功替換菌株菌落PCR得到片段大小為1 700 bp左右，與卡那基因片段大小相當；消抗后從圖3可以看到除了菌株3-8，其余15株菌經過菌落PCR得到大小為300 bp左右的片段，說明argB基因被成功敲除。由于利用Red/ET同源重組系統進行基因敲除會留下一個FRT“疤痕”，可能會對菌株生長造成影響，因此，本實驗對該15株菌進行了初步發酵，發現菌株3-4脯氨酸產量高于其他菌株，且高于菌株BL21(DE3)ΔputA(圖4)，得到菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB。

M-5 000 bp DNA Ladder Marker；1-E. coliBL21(DE3) ΔputA的菌落PCR結果；2-E. coli BL21(DE3) ΔputA抗性替換成功菌株的菌落PCR結果；3-抗性消除菌株的菌落PCR結果圖3 argB基因敲除菌株的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of argB gene knockout strain

1代表菌株BL21(DE3)ΔputA的初步發酵結果；2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16分別代表目標菌株 3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、3-6、3-7、3-9、3-10、3-11、3-12、3-13、3-14、3-15、3-16的初步發酵結果圖4 argB基因敲除菌株的初步發酵Fig.4 The preliminary fermentation of argB gene knockout strain

2.2 重組菌株的構建

通過材料與方法1.2.4中化學轉化的方法，構建菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH。通過使用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取重組菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH。質粒進行單雙酶切驗證(圖5)。質粒通過BamH I、KpnI進行雙酶切，分別獲得基因片段hyp-Ptrp2-proB2A(BH片段，3416 bp)、載體pUC19(2 686 bp)，結果如泳道1；表達載體通過BamH I進行單酶切，重組質粒的大小約6 102 bp，結果如泳道2；從圖5可以看出這些片段的大小均與預期目標相符，表明重組菌株構建成功。

M1-5000bp DNA Ladder Marker；M2-5000bp DNA Ladder Marker；1-雙酶切結果；2-單酶切結果圖5 表達質粒酶切電泳驗證Fig.5 The electrophoresis test and verify of recombinant plasmid pUC19-BH by enzyme digestion

2.3 氨基酸分析儀檢測發酵液中氨基酸成分

通過氨基酸分析儀進行初步定性分析結果(圖6)，可以發現菌株BL21(DE3)ΔputA/pUC19-BH與菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH發酵結果相比，前者精氨酸的含量明顯高于后者，精氨酸缺陷型菌株幾乎沒有精氨酸積累，這進一步證明后者精氨酸途徑被成功切斷。同時，我們看到發酵液中有反式-4-羥脯氨酸生成，說明羥化酶得到表達，菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH構建成功。

圖6 發酵液中各氨基酸分析結果Fig.6 The analytical results of amino acids in fermentation broth圖a-1，a-2：菌株BL21(DE3)ΔputA/pUC19-BH發酵液中氨基酸分析結果；圖b-1，b-2：無外源添加L-精氨酸時，菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH發酵液中氨基酸分析結果；圖c-1，c-2：外源添加適量L-精氨酸時，菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH與發酵液中氨基酸分析結果

2.4argB基因敲除菌株發酵參數

對敲除菌進行初步發酵，并測定菌株的發酵參數，從結果(圖7)中，我們發現精氨酸缺陷型菌株無論是生長狀況，葡萄糖消耗還是產反式-4-羥脯氨酸的能力均受到一定抑制。對于argB基因敲除菌株，該基因編碼的N-乙酰谷氨酸激酶的酶活幾乎為0 mU/mg，這更進一步說明argB基因被成功敲除。另外，研究發現，當培養基中外源添加1 g/L的L-精氨酸時，菌體的生長狀況得到了恢復，且反式-4-羥脯氨酸的產量與出發菌株相比有所提高。因此，后文L-我們對精氨酸的添加量進行了研究。

a-菌株BL21(DE3)ΔputA/pUC19-BH的發酵參數；b-無外源添加L-精氨酸時，菌株 BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH的發酵參數；c-外源添加1 g/L L-精氨酸時，菌株BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH的發酵參數圖7 argB基因敲除菌株發酵結果Fig.7 The fermentationresults of argB knockout strains

2.5L-精氨酸對BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH反式-4-羥脯氨酸產量的影響

由于菌株是L-精氨酸營養缺陷型，所以種子培養基中需要加入適量的精氨酸來滿足菌體生長的需求。本實驗研究了精氨酸不同濃度對菌體的生長。

argB基因的敲除，使得精氨酸合成受阻，菌株變為L-精氨酸缺陷型菌株，因此外源添加精氨酸，可以補充菌體生命活動所需的物質。BL21(DE3)ΔputAΔargB/pUC19-BH菌體生長能力的恢復，有利于反式-4-羥脯氨酸產量的進一步提高。發酵培養基中添加不同濃度的精氨酸，觀察菌體的生長及反式-4-羥脯氨酸產量情況，結果如圖8所示。隨著精氨酸濃度的增加，菌株的生長及反式-4-羥脯氨酸合成能力均有所提高。當發酵培養基中添加的L-精氨酸濃度達到600 mg/L后，隨著精氨酸添加量的增加，反式-4-羥脯氨酸產量增長趨勢變小。從生產成本考慮，選擇在培養基中添加600 mg/L的L-精氨酸，此時反式-4-羥脯氨酸產量達到 312.67 mg/L，較出發菌株BL21(DE3)ΔputA/pUC19-BH產量233.59 mg/L提高了25.29% ；細胞生長量也恢復到了親本水平。由此可見，精氨酸的添加有利于菌株的生長及反式-4-羥脯氨酸的積累。

圖8 L-精氨酸添加量的優化Fig.8 The optimization of addition amount of L-arginine

3 討論

本研究通過Red/ET同源重組系統進行基因敲除，成功構建了argB基因敲除菌株 BL21(DE3)ΔputAΔargB，結果發現該重組菌株的反式-4-羥脯氨酸產量有所提高。說明argB基因的敲除有利于反式-4-羥脯氨酸的生產。

argB基因編碼精氨酸合成途徑的乙酰谷氨酸激酶。敲除argB基因后，胞內精氨酸合成受阻，可能使更多前體谷氨酸流向L-脯氨酸合成途徑，從而提高作為反式-4-羥脯氨酸底物的L-脯氨酸產量。但L-精氨酸是必須氨基酸，對維持菌體正常生命活動有重要意義，所以其敲除影響了菌體的生長。我們對L-精氨酸的添加量進行了研究，結果發現適量的精氨酸添加可以使得敲除菌株恢復生長性狀，同時反式-4-羥脯氨酸的產量達到312.67 mg/L與實驗室原有水平相比有了顯著的提高。

該生產反式-4-羥脯氨酸的方法與原生產方法相比，原生產法方在搖瓶發酵時需要添加6～10 g/L的L-脯氨酸作為底物，而該生產方法只需添加0.6～1 g/L的L-精氨酸來滿足菌體生長；且L-脯氨酸的價格高于L-精氨酸。因此本文所構建的菌株在生產過程中展現出成本低，發酵過程易控制，發酵水平穩定等優勢，這為反式-4-羥脯氨酸的工業化生產奠定了良好基礎。

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Fermentative production oftrans-4-hydroxyproline with arginine-deficient strain

WANG Xiao-jiao,ZHANG Zhen-yu*,SUN Fu-bao*,YU Lin

(College of Bioengineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to obtain high-yield strains oftrans-4-hydroxyproline, based on the guidance ofE.colimetabolic network model and usingE.coliBL21 (DE3)ΔputAas the original strain, geneargBwas knocked out successfully, which blocked metabolic pathways branch ofL-glutamic acid,L-proline synthetic precursors and increased synthesis ofL-proline metabolic flux. The constructed arginine-deficient strainE.coliBL21 (DE3)ΔputAΔargBwas transformed with the expression plasmid pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp. The expression plasmid contains the mutant geneproB2encoding glutamate kinase that significantly reducedL-proline feedback inhibition. Fermentation results indicated thatthetrans-4-hydroxyproline production of recombinant strain reached 312.67 mg/L after addition of 600 mg/L exogenous arginine, which increased by 25.29% compared withE.coliBL21(DE3)ΔputA/ pUC19-proB2A-Ptrp2-hyp.

Escherichiacoli;trans-4-hydroxyproline; knockout; proline

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701005

碩士研究生(張震宇教授,孫付保副教授為通訊作者,E-mail:zhangzy@gmail.com;fubaosun@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(30970058)；江蘇省自然科學基金(BK2012554)；工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)開放課題基金(KLIB-ZR200801)

2016-07-18，改回日期：2016-09-09