木聚糖酶XynG1-1在畢赤酵母中的表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化

王停停，鄭宏臣，徐健勇，彭夢(mèng)，劉逸寒，路福平，宋詼*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300308) 3(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300308)

木聚糖酶XynG1-1在畢赤酵母中的表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化

王停停1,2，鄭宏臣2,3，徐健勇2,3，彭夢(mèng)1,2，劉逸寒1，路福平1，宋詼2,3*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457) 2(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，工業(yè)酶國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，天津，300308) 3(中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津工業(yè)生物系統(tǒng)與過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300308)

將來(lái)源于PaenibacilluscampinasensisG1-1的木聚糖酶編碼基因成功整合到畢赤酵母GS115基因組上，構(gòu)建了高產(chǎn)木聚糖酶XynG1-1的畢赤酵母工程菌。采用響應(yīng)面法對(duì)該工程菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。首先使用Design-Expert軟件進(jìn)行Plackett Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出影響產(chǎn)酶量的3個(gè)主要因素，即甲醇含量、生物素含量和培養(yǎng)時(shí)間。在此基礎(chǔ)上使用Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)響應(yīng)面分析得出優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)條件為：甲醇含量2.28%，培養(yǎng)時(shí)間37.29 h，生物素4 mg/L，酵母粉20 g/L，蛋白胨20 g/L，YNB 30 g/L，裝液量100 mL/L，轉(zhuǎn)速250 r/min、溫度28 ℃、磷酸緩沖液pH 6.0。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下胞外重組酶活達(dá)到707.2 IU/mL，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果一致，較優(yōu)化前木聚糖酶酶活提高了7.9倍，較原始菌株產(chǎn)酶量提高了19.8倍。經(jīng)10 L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)之后，重組木聚糖酶的酶活達(dá)到2 703 IU/mL。因此，該研究有效提高了木聚糖酶XynG1-1的發(fā)酵產(chǎn)量，并且，該重組酶保持了良好的酶學(xué)性質(zhì)，可為工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

畢赤酵母；木聚糖酶；響應(yīng)面；發(fā)酵優(yōu)化；酶學(xué)性質(zhì)

木聚糖酶(1,4-β-D-xylanase；EC3.2.1.8)是目前研究最為廣泛的半纖維素酶，也是一種重要的工業(yè)用酶，在造紙、食品、紡織、飼料等傳統(tǒng)工業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，木聚糖酶的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，其在醫(yī)藥、環(huán)境和能源等方面的應(yīng)用也正逐步被開發(fā)[1-3]。木聚糖酶的來(lái)源非常廣泛，主要存在于微生物、原生動(dòng)物、甲殼類動(dòng)物以及陸地植物組織中[4-5]。其中，微生物是木聚糖酶的最主要來(lái)源，約占所有來(lái)源的80%，其中，重要的木聚糖酶產(chǎn)生菌主要有：曲霉(Aspergilli)、木霉(Trichodermi)、青霉(Penicillium)、鏈霉菌(Streptomycetes)、芽胞桿菌(Bacillus)和瘤胃纖維菌(Rumihococci)等[6-9]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的木聚糖酶基因成功得到外源表達(dá)，進(jìn)而達(dá)到提高木聚糖酶產(chǎn)量的目的[10-11]。

畢赤酵母作為成熟的真核表達(dá)宿主具有諸多優(yōu)點(diǎn)：首先，作為真核表達(dá)系統(tǒng)，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能；并且，一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體復(fù)制而復(fù)制，不易丟失，具有很好的遺傳穩(wěn)定性；最重要的是該系統(tǒng)表達(dá)水平高并具有成熟的發(fā)酵工藝，易放大，大規(guī)模工業(yè)化高密度生產(chǎn)的細(xì)胞干重可高達(dá)100 g/L以上[12-13]。目前，已有一些真核來(lái)源的木聚糖酶在畢赤酵母中成功表達(dá)。王丹丹等人將黑曲霉XZ-3X菌株來(lái)源的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115中，在畢赤酵母中成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后比酶活達(dá)到43 526.3 U/mg[14]；袁冬華等人將橄欖綠鏈霉菌A1來(lái)源的木聚糖酶基因在畢赤酵母中表達(dá)，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的酶活達(dá)到了262.8 U/mL，將優(yōu)化好的搖瓶發(fā)酵條件應(yīng)用于7 L發(fā)酵罐，實(shí)現(xiàn)了木聚糖酶的高密度表達(dá)，酶活達(dá)到2 054.9 U/mL[15]。目前，關(guān)于細(xì)菌來(lái)源的木聚糖酶基因在畢赤酵母中表達(dá)的報(bào)道相對(duì)較少。

本研究前期篩選到1株產(chǎn)木聚糖酶的菌株P(guān)aenibacilluscampinasensisG1-1，該木聚糖酶具有很寬泛的pH穩(wěn)定性，在釀酒及造紙等行業(yè)均有很好的應(yīng)用潛力，將該木聚糖酶基因xynG1-1分別在原核宿主大腸桿菌和巨大芽孢桿菌中表達(dá)，發(fā)酵酶活分別為10.58 IU/mL和304.26 IU/mL，產(chǎn)量還有待提高[16-17]。因此，本文將木聚糖酶基因xynG1-1連接到真核表達(dá)載體pPIC-9k上，進(jìn)而重組到畢赤酵母GS115的染色體上。通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)畢赤酵母工程菌表達(dá)木聚糖酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并將最優(yōu)發(fā)酵條件放大到10 L發(fā)酵罐，實(shí)現(xiàn)重組木聚糖酶的高密度發(fā)酵，為進(jìn)一步提高木聚糖酶產(chǎn)量和大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

木聚糖酶原始菌株P(guān)aenibacilluscampinasensisG1-1由天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

酵母粉、蛋白胨：OXOID公司；D-葡萄糖、YNB、TRIS、木糖：Solarbio公司；NaOH：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4、K2HPO4：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；生物素：BIO BASIC INC公司；樺木木聚糖：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

BMGY培養(yǎng)基：溶解10 g酵母粉，20 g蛋白胨于700 mL水中，高壓滅菌20 min，冷至室溫，加入下列混合液：100 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0，100 mL 10×YNB，100 mL 10×甘油，2 mL 500×生物素。BMMY培養(yǎng)基：溶解10 g酵母粉，20 g蛋白胨于700 ml水中，高壓滅菌20 min，冷至室溫，加入下列混合液：100 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液pH 6.0，100 mL 10×YNB，100 mL 10×甲醇，2 mL 500×生物素。YPD培養(yǎng)基：溶解10 g酵母粉，20 g蛋白胨于900 mL水中(配置固體培養(yǎng)基時(shí)加入20 g/L瓊脂粉)，高壓滅菌20 min，加入100 mL 10×D。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SKY-2111B全溫培養(yǎng)搖床，天津億諾科學(xué)儀器有限公司；MJX-100B-Z型培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Epoth 2TC微孔板分光光度計(jì)，美國(guó)伯騰儀器有限公司；BIOTECH-10BGZ-2全自動(dòng)兩聯(lián)10 L發(fā)酵系統(tǒng)，上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 畢赤酵母工程菌的構(gòu)建

以P.campinasensisG1-1基因組為模板，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增木聚糖酶基因xynG1-1，PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和NotI雙酶切后，連接到pPIC-9k表達(dá)載體，得到重組質(zhì)粒pPIC9k-xynG1-1，重組質(zhì)粒經(jīng)SacI線性化后，電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115細(xì)胞中，應(yīng)用AOX引物和木聚糖酶基因引物PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)

通過(guò)平板劃線法將重組畢赤酵母接種至YPD固體培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至單克隆出現(xiàn)，挑取單克隆菌落至BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至一定濃度。離心棄上清液，將菌體轉(zhuǎn)移至等體積BMMY培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)。每隔24 h取樣1 mL，并添加相應(yīng)含量甲醇。樣品離心，將上清稀釋適當(dāng)倍數(shù)測(cè)定酶活，上清和沉淀分別存于-20 ℃。

1.2.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

選取9個(gè)因素(甲醇含量、培養(yǎng)時(shí)間、生物素含量、酵母粉含量、蛋白胨含量、YNB含量、裝液量、pH和溫度)進(jìn)行Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)(因素水平設(shè)計(jì)見表1)，以確定影響發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素

1.2.4 顯著因素的單因素水平實(shí)驗(yàn)

對(duì)Plackett-Burman確定的3個(gè)主要因素A(甲醇含量)、B(培養(yǎng)時(shí)間)、C(生物素含量)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，確定3個(gè)因素的3個(gè)合適水平A、B、C(-1、0、1)。

1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)A、B、C三個(gè)因素的最終選取結(jié)果，使用Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，其他發(fā)酵條件保持一致，共選取17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，包含12個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表2。

1.2.6 10 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

挑取重組畢赤酵母單克隆菌落于100 mL YPD液體培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min培養(yǎng)至OD600nm=10左右，并將種子液加到含3 L初始培養(yǎng)基的10 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵過(guò)程分為甘油單批培養(yǎng)，甘油分批補(bǔ)料培養(yǎng)和甲醇分批補(bǔ)料培養(yǎng)3個(gè)不同階段。每隔一段時(shí)間取樣并測(cè)OD600nm、細(xì)胞濕重和酶活，繪制菌體生長(zhǎng)曲線，并進(jìn)行蛋白檢測(cè)。

1.2.7 木聚糖酶酶活測(cè)定

木聚糖酶活力測(cè)定使用DNS法[17]。取100 μL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液，加入100 μL 1%的樺木木聚糖底物溶液，60 ℃反應(yīng)10 min，加入600 μL DNS終止反應(yīng)，沸水浴10 min，測(cè)定540 nm處的吸光值。木聚糖酶活力單位的定義：以1%的可溶性樺木木聚糖為底物，在酶的最適反應(yīng)條件下，每分鐘分解木聚糖生成1 μmol 木糖所需酶量為1個(gè)酶活力單位(IU)。

1.2.8 重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

將發(fā)酵上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，分別在40、45、50、55、60、65、70、75 ℃測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，確定最適反應(yīng)溫度。將稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液分別放置在50、55、60 ℃水浴鍋中，每隔一段時(shí)間分別測(cè)定酶活，以初始酶活為100%，測(cè)定重組木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性。

將發(fā)酵上清液用不同的pH(5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5)緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，分別用相應(yīng)pH的底物測(cè)定酶活，以最高酶活為100%，確定最適反應(yīng)pH。將酶液分別用pH 6、6.5、7、7.5緩沖液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，放置4 ℃冰箱，每隔一段時(shí)間測(cè)定酶活，以初始酶活為100%，測(cè)定重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)木聚糖酶畢赤酵母工程菌的構(gòu)建

按圖1所示成功構(gòu)建了畢赤酵母重組質(zhì)粒pPIC9k-xynG1-1，質(zhì)粒全長(zhǎng)1 081 bp，將重組質(zhì)粒經(jīng)SacI 線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115細(xì)胞中，得到128個(gè)轉(zhuǎn)化子，經(jīng)AOX引物和目的片段引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(圖2)，測(cè)序正確的為構(gòu)建成功的產(chǎn)木聚糖酶XynG1-1的畢赤酵母工程菌。

圖1 畢赤酵母重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram for construction of recombinant plasmid for P. pastoris

泳道1～5為AOX引物PCR結(jié)果，泳道6～10為木聚糖酶基因引物PCR結(jié)果圖2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.2 PCR analysis of P. pastoris transformants

2.2 重組畢赤酵母菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

依據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的9個(gè)培養(yǎng)基成分進(jìn)行考察，每個(gè)因素取高和低兩個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。各因素所代表的參數(shù)水平和方差分析結(jié)果如表2。研究的9個(gè)因素中，甲醇含量(A)、培養(yǎng)時(shí)間(B)、生物素含量(C)3個(gè)因素對(duì)重組木聚糖酶酶活產(chǎn)生顯著影響。繼而對(duì)3個(gè)顯著性因素進(jìn)行不同水平的單因素實(shí)驗(yàn)，而其他6個(gè)非顯著性因素在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的取值由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定。各因素對(duì)產(chǎn)酶影響可用以下方程表示(其中A代表甲醇含量、B為培養(yǎng)時(shí)間、C為生物素含量、D為酵母粉含量、E為蛋白胨含量、F為YNB含量、G為裝液量、H為pH值、I為溫度)：

酶活=362.38+38.08A+69.93B-34.01C+18.91D-14.89E+14.89F+35.52G+14.12H-28.33I

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

方程的決定系數(shù)R2=0.988 9，說(shuō)明方程的擬合程度較好。在后續(xù)試驗(yàn)過(guò)程中酵母粉、YNB和裝液量3個(gè)因素在高點(diǎn)取值，而蛋白胨、溫度和pH值3個(gè)因素在低點(diǎn)取值。進(jìn)而繼續(xù)3個(gè)顯著因素最適條件的確定。

表2 偏回歸系數(shù)及因素的顯著性分析

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)確定Box-Behnken實(shí)驗(yàn)的水平范圍

在后續(xù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中，需要確定3個(gè)顯著性因素的3個(gè)水平(-1、0、1)。應(yīng)用單因素實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同甲醇含量、不同培養(yǎng)時(shí)間、不同生物素含量對(duì)重組木聚糖酶表達(dá)的影響。由圖3a結(jié)果可見，在甲醇含量為2%時(shí)重組木聚糖酶酶活最大，甲醇含量為1%和4%時(shí)酶活明顯降低，因此選取A(甲醇含量)因素的3個(gè)水平分別為1、2.5、4%；培養(yǎng)時(shí)間在36、60、84 h時(shí)酶活差距明顯(圖3b)，從而確定B(培養(yǎng)時(shí)間)因素的3個(gè)實(shí)驗(yàn)水平；另外，對(duì)于因素C(生物素含量)的水平選擇0 、2 、4 mg/L較為合適(圖3c)。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)2.2和2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Box-Behnken軟件設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，根據(jù)表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，使用Design-Expert軟件進(jìn)行方差分析和二次回歸擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，回歸方程變量分析見表4。

a-甲醇含量對(duì)重組木聚糖酶產(chǎn)量的影響；b-培養(yǎng)時(shí)間對(duì)重組木聚糖酶產(chǎn)量的影響；c-生物素含量對(duì)重組木聚糖酶產(chǎn)量的影響圖3 顯著影響因素的單因素水平實(shí)驗(yàn)Fig.3 The influences on xylanase yields by different levels of the three notable factors

以重組木聚糖酶酶活(R1)為響應(yīng)面值，以A、B、C為自變量，擬合得到多元二次回歸方程：

R1=506.16-46.27A-57.06B+13.09C+17.87AB+15.38AC-7.80BC-165.61A2-35.58B2+9.92C2

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)及方差分析可知，模型實(shí)驗(yàn)擬合良好，模型的p=0.004 8<0.05，說(shuō)明該試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著。決定系數(shù)R2=0.917 3，說(shuō)明回歸方程的擬合程度較好。由響應(yīng)面回歸分析和回歸方程擬合繪制響應(yīng)面圖形(如圖4)。

a-甲醇含量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的影響；b-甲醇含量和生物素含量對(duì)產(chǎn)酶量的影響；c-培養(yǎng)時(shí)間和生物素含量對(duì)產(chǎn)酶量的影響圖4 三個(gè)顯著性因素之間的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)Fig.4 The response surface experiments for the three significant factors

由圖4可見，A、B、C三個(gè)影響因素之間存在極值點(diǎn)。進(jìn)而對(duì)方程求導(dǎo)，得到模型的極值點(diǎn)，3個(gè)因子的最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)分別為甲醇含量2.28%、培養(yǎng)時(shí)間37.29 h、生物素含量4 mg/L，此時(shí)模型預(yù)測(cè)的極大值為562.1 IU/mL。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

在其余培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不變的情況下，對(duì)模型預(yù)測(cè)的最優(yōu)條件(即甲醇含量2.28%、培養(yǎng)時(shí)間37.29 h、生物素含量4 mg/L)進(jìn)行3組平行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)得最終重組木聚糖酶平均酶活為707.2 IU/mL，比預(yù)測(cè)酶活值偏大1.26%，取得了預(yù)期的優(yōu)化效果。另外，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較，本實(shí)驗(yàn)獲得的畢赤酵母工程菌表達(dá)木聚糖酶XynG1-1的水平較其原始菌株(35.72 IU/ml)提高了19.8倍[16]，比該基因在大腸桿菌和巨大芽孢桿菌中表達(dá)水平分別高66.8倍和2.3倍[17]，可見，對(duì)于該木聚糖酶基因xynG1-1來(lái)說(shuō)，畢赤酵母可能是其目前最合適的表達(dá)宿主。

a-重組畢赤酵母工程菌生長(zhǎng)曲線圖；b-工程菌胞外蛋白電泳圖。M-Marker，GS115: 畢赤酵母GS115原始菌對(duì)照；1～8：誘導(dǎo)1～8 d的工程菌胞外蛋白圖5 10 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Fermentation results in a 10 L fermentor

試驗(yàn)號(hào)A/%B/hC/(mg·L-1)酶活/(IU·mL-1)11604388.522.5602530.432.5360565.442.5840400.151600362.462.5602506.372.5602487.781842331.092.5602506.2102.5844380.0112.5364576.5121362414.1132.5602500.2144362243.2154842231.6164600281.7174604369.3

2.6 10 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)

在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)上，進(jìn)行10 L發(fā)酵罐的放大培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。重組畢赤酵母發(fā)酵189 h時(shí)，菌體生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，細(xì)胞濕重達(dá)到346 g/L，重組木聚糖酶的酶活達(dá)到2 703 IU/mL，較搖瓶發(fā)酵酶活提高了3.8倍(如圖5a)。重組木聚糖酶的蛋白大小為40 kDa左右，與預(yù)測(cè)的蛋白大小一致，而陽(yáng)性對(duì)照GS115在此處沒(méi)有蛋白表達(dá)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)的重組蛋白量增加。并且由圖5b可見，重組木聚糖酶蛋白量占該畢赤酵母表達(dá)胞外蛋白90%以上，雜蛋白極少，具有良好的工業(yè)生產(chǎn)潛力。

表4 回歸方程變量分析

2.7 酶學(xué)性質(zhì)

本研究還對(duì)重組木聚糖酶XynG1-1的酶學(xué)性質(zhì)做了初步測(cè)定，重組木聚糖酶XynG1-1的最適作用溫度是55 ℃(圖6a)。在50、55 、60 ℃保溫30 min剩余酶活分別為68%、61%和57%(圖6b)。重組木聚糖酶XynG1-1的最適作用pH為6.5(圖6c)，該木聚糖酶在pH 6.0～7.5范圍內(nèi)具有極好的穩(wěn)定性(圖6d)。

a-不同溫度對(duì)重組木聚糖酶活性的影響；b-重組木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性；c-不同pH對(duì)重組木聚糖酶活性的影響；d-重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性圖6 重組木聚糖酶XynG1-1的酶學(xué)性質(zhì)Fig.6 The enzymatic properties of the recombinant xylanase XynG1-1

3 結(jié)論

本研究將來(lái)源于P.campinasensisG1-1的木聚糖酶基因成功重組到畢赤酵母GS115基因組上，實(shí)現(xiàn)了組成型表達(dá)，響應(yīng)面法發(fā)酵條件優(yōu)化使得表達(dá)水平提高了7.9倍，優(yōu)化后搖瓶表達(dá)水平達(dá)到707.2 IU/mL，分別是原始菌的19.8倍、大腸桿菌工程菌的66.8倍、巨大桿菌工程菌的2.3倍。可見木聚糖酶XynG1-1在畢赤酵母中的表達(dá)水平最高。經(jīng)10 L發(fā)酵罐的高密度發(fā)酵培養(yǎng)，最終胞外酶活可達(dá)到2 703 IU/mL，結(jié)合其優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，本研究可顯著推進(jìn)木聚糖酶XynG1-1的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用進(jìn)程。

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Expression of xylanase XynG1-1 inPichiapastorisand optimization of its fermentation conditions

WANG Ting-ting1,2,ZHENG Hong-chen2,3,XU Jian-yong2,3,PENG Meng1,2,LIU Yi-han1,LU Fu-ping1,SONG Hui2,3*

1(College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China) 2(Industrial Enzymes National Engineering Laboratory, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China) 3(Key Laboratory of Tianjin IndustrialBiosystem and Process Engineering, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China)

The gene encoding xylanase fromPaenibacilluscampinasensisG1-1 was successfully integrated into the genome ofPichiapastorisGS115, and engineeredP.pastorisfor high-yielding xylanase XynG1-1 was constructed. The fermentation conditions of the engineered bacteria were optimized by using the response surface method. Firstly, Plackett Burman design was carried out using Design-Expert software and three main factors influencing the yield of xylanase were screened out, which were content of methanol, content of biotin and incubation time. Then the Box-Behnken of Design-Expert software was used to design the experiment, the optimize culture conditions for fermentation were confirmed by the analysis of the response surface to be follows: yeast powder of 20 g/L, peptone of 20 g/L, YNB of 30 g/L, biotin of 4 mg/L, methanol content of 2.28%, liquid volume of 100 mL/L, incubation time of 37.29 h, rotational speed of 250 r/min, temperature 28 ℃, phosphate buffer pH 6.0. Verified by experiments, the extracellular recombined enzyme activity under the optimized cultivation condition was 707.2 IU/mL, which was consistent with the prediction of the response surface method and was 7.9-fold of the former xylanase enzyme activity and 19.8-fold of the enzyme activity produced by original strains. After enlarged culture in 10 L fermentation tank, the recombined xylanase enzyme activity reached 2 703 IU/mL. Therefore, this study effectively improved the fermentation yield of xylanase XynG1-1, and the recombinant enzyme retained better enzymology properties. It established foundation for the further industrial production and application of xylanase XynG1-1.

Pichiapastoris; xylanase; response surface; optimization of fermentation; enzymology properties

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701007

碩士研究生(宋詼研究員為通訊作者,E-mail：song_h@tib.cas.cn)。

國(guó)家“863”計(jì)劃(2014AA021302、2014AA021303)；中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)部署項(xiàng)目(KFZD-SW-201-2A)；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目(13ZCDZSY05000)

2016-07-05，改回日期：2016-08-29