一種青稞格瓦斯的制備及揮發性風味成分分析

李玉斌，吳華昌，肖猛，唐紅梅，嚴夢琴，劉陽，鄧靜*

1(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢，643000) 2(四川旅游學院,烹飪科學省重點實驗室，四川 成都，610000)

一種青稞格瓦斯的制備及揮發性風味成分分析

李玉斌1，吳華昌2，肖猛2，唐紅梅2，嚴夢琴2，劉陽2，鄧靜2*

1(四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢，643000) 2(四川旅游學院,烹飪科學省重點實驗室，四川 成都，610000)

采用單因素及正交試驗對以青稞原料的格瓦斯發酵工藝進行優化，并利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(SPME-GC-MS)分析青稞格瓦斯揮發性風味成分。結果表明：原料經滅酶處理所得青稞汁中β-葡聚糖含量比未滅酶處理提高了36.08%；最佳發酵條件為青稞汁含量(以白利度計)14%，菌種添加量1.4 g/L，面包酵母菌與乳酸菌的添加比例為1∶1，溫度30 ℃，時間10 h；經10 h熟化后，獲得的青稞格瓦斯總酸度為1.76 g/L、酒精度為2.13% vol、 β-葡聚糖含量為15.75 mg/L、 氨基氮含量為12.26 mg/100 mL；其主要揮發性風味成分為乙醇(53.46%)、異戊醇(13.08%)、苯乙醇(6.09%)、乙酸異戊酯(3.17%)等；色澤金黃透亮、酸甜苦味均衡、有成熟水果香與酒香。

青稞；格瓦斯；發酵；熟化；揮發性風味成分

青稞是一種禾谷類作物，具有豐富的營養價值和突出的醫藥保健作用[1-2]，主要分布于西藏、青海、甘肅及四川阿壩、甘孜州等地區。近年來的研究[3-4]表明青稞中含有豐富的具有抗腫瘤作用的β-葡聚糖，平均含量為5.25%，最高可達8.6%，遠遠高于皮大麥、小麥和燕麥[5]；此外，青稞中含有6.35～21.00%蛋白質，高于小麥、水稻、玉米[6]。目前，青稞主要用于糧食加工制品、飲料工業、青稞功能因子的提取以及飼料工業等[6]。其中，青稞飲品的研發主要集中在青稞白酒[7]、啤酒、青稞汁復合飲料[8-10]、乳酸菌發酵飲料[11]等。

“格瓦斯”最早起源于俄國，是用面包干浸提液經自然發酵而成的色澤近似啤酒、酸甜適度、口感清香的低酒精度飲料[12]，具有養胃、開胃、健脾、降血壓、消除疲勞等作用[13]。目前，市場上在售的格瓦斯產品有杭州娃哈哈格瓦斯、俄羅斯歐奇科娃格瓦斯、哈爾濱秋林格瓦斯與莫得利格瓦斯等，其多以麥芽汁或面包干浸提液添加酵母菌或乳酸菌發酵制得[14]。關于格瓦斯的研究主要集中在新品格瓦斯的研發，包括谷物(麥芽、大米、玉米、薯類等)[15-16]、水果[17-19]、蔬菜[20]、花卉[21]等，而以青稞為原料的格瓦斯未有報道。

研究以青稞為原料，采用單因素與正交設計對青稞格瓦斯發酵工藝進行優化，經熟化、過濾獲得青稞格瓦斯成品，利用SPME-GC-MS技術鑒定格瓦斯風味成分。研究旨在為青稞格瓦斯的研發提供一定參考，以期增加青稞的產品附加值、提高我國西部青稞種植戶收入。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞，四川省甘孜州地區；乳酸菌粉，南京優能生物科技有限公司；葡萄酒、面包、生香活性干酵母，安琪酵母有限公司。

α-淀粉酶(3 700 u)、糖化酶(100 000 u)，北京奧博星生物技術有限公司；燕麥β-葡聚糖(純度≥95%)，Sigma公司；剛果紅(AR)，美國Amresco公司；甲醛(AR)，成都金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV Blue Star紫外可見分光光度計，北京萊伯泰科儀器有限公司；57306型頂空固相微萃取儀，美國Supelco公司；50/30 μm DVB/AR/PDMS萃取頭，Agilent-5975氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司；GL-22MC型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 青稞格瓦斯工藝流程圖

青稞原料預處理→液化→糖化→過濾→滅酶→接種→發酵→貯存熟化→過濾→滅菌→成品

1.3.2 青稞格瓦斯工藝操作要點

原料前處理：選擇無腐爛、病蟲害及機械損傷的青稞，經脫皮、粉碎(60目過篩)獲得青稞粉。稱取適量的青稞粉，按料水比1∶(4～5)加水，95～100 ℃沸騰8～10 min進行滅酶，滅酶完成后將料液冷卻至50～60 ℃；

液化：用食品級碳酸氫鈉調節料液pH為6.0～7.0，按每克青稞粉40～60 u添加α-淀粉酶，于55～65 ℃恒溫水浴鍋中液化50～60 min；

糖化：用食品級檸檬酸調節液化后料液的pH值為4.0～4.5，按每克青稞粉120～140 u添加糖化酶，于55～60 ℃的恒溫水浴鍋中糖化6～8 h；

過濾： 8層紗布過濾糖化后的料液，于95～100 ℃沸騰8～10 min進行滅酶，再將料液冷卻至3～5 ℃，自然沉淀1 h以上，抽取上清液，獲得澄清的青稞汁；

青稞汁成分調整：采用添加蔗糖或加水稀釋的方法，調節青稞汁含量為14%；用食用級檸檬酸調節青稞汁的pH為5～6；

發酵菌劑活化：將活性干酵母菌劑與乳酸菌劑按需要量添加到50 mL青稞汁中，攪拌溶解，保溫活化25～30 min，然后冷卻至28～30 ℃，備用；

過濾：將熟化的青稞格瓦斯經4 ℃、6 000 r/min、15 min離心，棄去沉淀，獲得上清液。

1.3.3 青稞原料的預處理

稱取等量的2組青稞粉，按料水比1∶(4～5)加水，一組經95～100 ℃高溫沸騰8～10 min，另一組未進行處理。2組料液經液化、糖化、過濾制得青稞汁，測定青稞汁的β-葡聚糖、還原糖、氨基氮含量及白利度。

1.3.4 青稞格瓦斯發酵菌劑的選擇

按1.8 g/L添加量準確稱取菌劑(酵母菌與乳酸菌比例為1∶1)于50 mL青稞汁，活化后，接種到裝有青稞汁的發酵瓶中，30 ℃發酵10 h，比較酵母菌、乳酸菌、面包酵母+乳酸菌、啤酒酵母+乳酸菌、生香酵母+乳酸菌發酵所得格瓦斯粗品的酒精度、酸度、β-葡聚糖、還原糖含量及感官評價，選取最優格瓦斯發酵菌劑組合。

1.3.5 青稞格瓦斯發酵工藝優化

分別考察青稞汁含量(以白利度計)、菌種添加量、添加比例(面包酵母：乳酸菌)、發酵溫度、時間對青稞格瓦斯感官評價的影響。在單因素試驗的基礎上設計7因素3水平正交試驗，確定最佳發酵條件。此外，增加兩個空白列來反映試驗誤差。

1.3.6 貯存熟化時間的確定

將青稞格瓦斯粗品于低溫條件(3～5 ℃)下熟化，分別在第0、5、10、15、20 h測定格瓦斯粗品的pH值、白利度、還原糖、總酸度，確定格瓦斯最佳熟化時間。

1.3.7 分析方法

pH: pH計測定；白利度：手持糖度計測定；酒精度：酒精計法測定[22]；總酸度：pH電位法測定[13]；還原糖：滴定法測定[23]；β-葡聚糖：剛果紅法測定[24]；氨基氮：甲醛滴定法。

感官評價：實驗主要圍繞外觀、滋味、風味、典型性對青稞格瓦斯進行感官評定[25]。10位品評人員對青稞格瓦斯感官特征進行描述，依次對各項指標進行權重與尺度建立，評價標準見表1。

表1 青稞格瓦斯感官評分表

1.3.8 青稞格瓦斯揮發性風味成分鑒定

1.3.8.1 頂空固相微萃取(Headspace SPME)條件

量取青稞汁、青稞格瓦斯樣品各8.0 mL于15 mL樣品瓶中，將老化的50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭插入樣品瓶頂空部分，70 ℃平衡30 min、吸附10 min后，將萃取頭取出并插入GC進樣口，同時啟動儀器采集數據，解吸3 min。

1.3.8.2 GC-MS分析條件

HP 5890/5975 GC/MS聯用儀, 色譜柱：HP-5MS型(30 m×0.250 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣；進樣溫度：230 ℃；進樣量: 1 μL；升溫程序：初溫50 ℃保持2 min，5 ℃/min上升至180 ℃，保持1 min，25 ℃/min升到230 ℃，保持5 min。

1.3.8.3 數據處理

由計算機質譜系統NSIT與RTLPEST檢索未知化合物，匹配度大于800(最大1 000)的結果將予以報告，面積歸一法計算各成分的相對含量。

1.3.9 數據處理

采用IBM SPSS Statistics19.0進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 青稞的預處理

現有格瓦斯工藝多采用先谷物發芽提高相應酶系的活力(淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶等)[26]，經蛋白質、淀粉分解獲取谷物汁，以期節約成本、提高生產效率。由于青棵籽粒中內源性β-葡聚糖酶的活力隨著青稞發芽逐漸提高，造成β-葡聚糖損失[27]。原料進行滅酶處理后，可較大限度地減少β-葡聚糖損失。實驗對比滅酶與未滅酶處理所得青稞汁理化指標(見表2)。

表2 不同預處理對青稞汁理化指標影響

由表2可知，青稞經滅酶處理后，所得青稞汁中β-葡聚糖含量增加了36.08%，這可能是高溫使青稞中β-葡聚糖內切酶失活所致。但青稞汁中固形物、還原糖與氨基氮含量分別下降22.11%、18.27%、52.16%，可能是由于青稞中的酶系(α-淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶、過氧化氫酶、過氧化物酶和多酚氧化酶等)[26]在高溫條件下部分或全部失活，導致蛋白質、木聚糖、多酚、糊精等難溶于水的大分子物質未被分解或轉化為易溶于水的物質。因此，青稞進行滅酶處理后，可較大限度減少β-葡聚糖的損失。

2.2 青稞格瓦斯發酵劑的選擇

格瓦斯發酵過程中，乳酸菌產生乳酸、乙酸、琥珀酸、蘋果酸、丁二酸等酸類物質，酵母菌則賦予格瓦斯獨特的醇香味和微量的酒精度[28]。酵母菌與乳酸菌混合發酵，不僅有利于有機酸和醇類通過非酶催化作用生成酯類物質，賦予食品甜香、果香[29]，而且可均衡格瓦斯中甜味、酸味、醇味與香味。實驗對比不同菌劑組合發酵所得格瓦斯粗品的品質，結果如表3所示。

表3 不同菌劑組合發酵對格瓦斯粗品品質的影響

由表3可知：與單菌發酵相比，混菌發酵(面包酵母+乳酸菌)所得格瓦斯粗品中β-葡聚糖含量及感官評分均最高，分別為15.18 mg/L、6.5分。β-葡聚糖含量高可能是因為酵母菌將L-苯丙氨酸經中脫氨、脫羧、還原作用產生及衰亡破裂的菌體細胞壁中β-葡聚糖釋放所致。但混菌發酵格瓦斯粗品中酸度、還原糖含量最低，分別為1.7 g/L、4.49 g/100 mL，其中酸度僅為面包酵母單獨發酵時的64.40%，還原糖含量為乳酸菌單獨發酵時的55.80%。混菌發酵格瓦斯粗品中酸度含量在1.5～1.8 g/L，此范圍內格瓦斯酸味最爽口[30]，此外低糖分環境可避免雜菌生長，有利于保藏。混菌發酵格瓦斯粗品的酒精度與氨基氮含量均適中，分別為2.10%、12.37 mg/100 mL。因此，應選擇混菌發酵的方式，所得格瓦斯粗品β-葡聚糖含量及感官評價均最高、還原糖含量低、酸味爽口、酒精度適中。

3種混菌發酵方式相比，葡萄酒酵母+乳酸菌發酵格瓦斯粗品的酸度、β-葡聚糖含量及感官評價均最高，分別為2.18 g/L、17.93 mg/L、6.8分，酸度高可能是因為葡萄酒酵母的某些代謝產物促進乳酸菌產酸；葡萄酒酵母+乳酸菌發酵格瓦斯粗品還原糖與氨基氮含量均最低，分別為4.41 g/100 mL、12.13 mg/100 mL。但由于葡萄酒酵母菌劑成本高，面包酵母+乳酸菌酵母與葡萄酒酵母+乳酸菌發酵所得格瓦斯粗品除酸度外，其余各項指標相差不大。所以采用面包酵母+乳酸菌作為青稞格瓦斯發酵菌劑。

2.3 青稞格瓦斯最佳發酵條件的確定

2.3.1 單因素試驗

分別固定青稞汁含量14%、菌種添加量1.8 g/L、面包酵母與乳酸菌的添加比例為 2∶1、發酵溫度25 ℃、發酵時間8 h。依次改變青稞汁濃度(10%、12%、14%、16%、18%)、菌種添加量(1.0、1.4、1.8、2.2、2.6 g/L)、添加比例 (酵母∶乳酸菌比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)、發酵溫度(20、25、30、35、40 ℃)、發酵時間(4、6、8、10、12 h)，對格瓦斯粗品進行感官評定(見圖1)。由圖1可知：單因素最佳發酵條件為青稞汁含量14%、菌種添加量1.8 g/L、添加比例1∶1、發酵溫度30 ℃、時間10 h。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Theresults of single factor experiment

2.3.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，設計7因素3水平正交試驗(表頭見表5)，考察青稞汁濃度、菌種添加量、添加比例、發酵溫度、時間對格瓦斯的感官品質的影響(見表6)。

表5 正交試驗水平設計表

表6 正交試驗結果

續表6

試驗號列號A空列BCD空列EFG感官評價/分522233116.9623311227.37 3(16%)1213237.0832321317.1933132127.41011332216.81112113325.11213221136.61321231327.31422312138.41523123218.01631323126.91732131236.91833212315.6

采用IBM SPSS Statistics 19.0進行正交試驗的數據處理,結果如下。

表7 正交試驗方差分析表(α=0.05)

表8 正交試驗多重比較結果(LSR法)

由表7中各因素的顯著性系數可知，對感官評價的影響程度依次為A(麥芽汁濃度)>D(菌種添加量)>C(發酵時間)>F(菌種添加比例)>G(發酵溫度)>E(空白列)>B(空白列)。由表8中各因素在不同水平下的均值可知：最優的組合是A2C3D2F2G3，即青稞汁濃度為14%、菌種添加量為1.8g/L、添加比例(酵母菌：乳酸菌)為1∶1、發酵溫度為35 ℃、時間為10h。同時，由因素間各水平的多重比較結果可知，A1與A2差異顯著，其余因素各水平間均不顯著。從生產成本考慮，調整青稞格瓦斯發酵工藝參數為：青稞汁濃度14%，菌種添加量1.4g/L，添加比例(酵母菌∶乳酸菌)1∶1，發酵溫度30 ℃，時間10h。

2.4 青稞格瓦斯貯存熟化理化指標變化

發酵完成的青稞格瓦斯粗品含有多種醇類與酸類物質，導致氣味刺激、口感辛辣。將其置于3～5 ℃的環境，通過減緩酵母菌和乳酸菌的生長代謝，促進酯類物質(乳酸乙酯等)的形成，賦予飲料醇厚的酒香味。青稞格瓦斯熟化過程中，理化指標變化如圖2所示。

由圖2可知：在0～5 h，格瓦斯粗品白利度、還原糖含量、總酸度變化不大，這可能是因為菌體在低溫環境中代謝速度減緩導致，同時低溫導致弱電解質的電離能力發生改變，使pH值下降。在5～10 h，白利度、總酸度、pH略有上升，還原糖含量下降，可能是由于殘留菌體后酸化所致[31]。到10～20 h，各項理化指標基本趨于穩定。因此，青稞格瓦斯最佳熟化時間為10 h，所得格瓦斯的理化指標見表9。

2.5 青稞格瓦斯揮發性風味成分鑒定

準確量取青稞汁、青稞格瓦斯成品各8.0 mL，經頂空固相萃取后進行GCMS分析，結果見表10。

青稞汁中共檢測出1種風味物質，為苯乙醇(14.75%)，而發酵完成的青稞格瓦斯中共檢測出17種風味物質，其中醇類4種、酯類11種、醛類1種、其它類1種，主要風味物質為乙醇(53.46%)、異戊醇(13.08%)、苯乙醇(6.09%)、乙酸異戊酯(3.17%)等。

圖2 熟化過程中青稞格瓦斯理化指標變化Fig.2 The changes of physical and chemical indicators in the maturation process of highland barley kvass

指標白利度/%還原糖含量/[g·(100mL)-1]酸度/(g·L-1)pH值酒精度/%volβ-葡聚糖含量/(mg·L-1)氨基氮含量/[mg·(100mL)-1]參數12.9±0.087.75±0.171.76±0.084.51±0.012.10±0.0315.75±0.0612.26±0.05

表10 青稞汁與青稞格瓦斯風味成分

注：“-”表示未檢測出。

青稞汁中檢測出醇類物質1種(苯乙醇)，相對含量為14.75%，經發酵、熟化后，青稞格瓦斯中醇類物質增加到4種，總相對含量為73.94%， 分別為乙醇(53.46%)、苯乙醇(6.09%)、異戊醇(13.08%)、異丁醇(1.31%)，構成青稞格瓦斯的主要風味成分。其中，苯乙醇是青稞汁中主要風味物質，在青稞格瓦斯中苯乙醇相對含量減少到6.09%，降低了58.71%；苯乙醇具有玫瑰與丁香花香氣，有先苦后甜的桃子樣味道[32]，其來源有2條途徑：一部分來自于青稞汁，另一部分來自于L-苯丙氨酸經釀酒酵母中脫氨酶、脫羧酶、還原酶作用產生[33]，其在發酵、熟化過程中可與酸類物質發生酯化反應或被氧化為醛類物質，導致其含量降低。異丁醇與異戊醇分別具有雜醇油與酒精氣味、蘋果白蘭地香氣與辛辣味，這2種物質分別由纈氨酸、亮氨酸經艾爾利希途徑產生[34]。

青稞汁中未檢測出酯類物質，青稞格瓦斯成品中檢測出11種酯類物質，包括乙酸異戊酯(3.17%)、葵酸乙酯(2.65%)、月桂酸乙酯(1.56%)等，總相對含量為13.03%。格瓦斯中酯類物質以乙酯類化合物為主，這類化合物大多呈現出水果香、花香[33]，在發酵中主要由醇與酸發生酯化反應產生，貯存熟化中則主要發生支鏈酯的酯化反應和高濃度直鏈酯的水解反應。

青稞汁中未檢測醛類物質，格瓦斯成品中檢測出1種醛類物質(苯乙醛)，相對含量為0.95%，苯乙醛具有類似風信子的香氣、特殊的杏仁氣味，該物質廣泛存在于酒類產品中[33]，主要由苯乙醇通過氧化作用產生。

3 結論

采用單因素與正交試驗確定青稞格瓦斯最佳發酵條件為：青稞汁濃度14%、菌種添加量1.4 g/L、添加比例(面包酵母菌∶乳酸菌)1∶1、發酵溫度30 ℃、時間10 h，于3～5 ℃熟化10 h，經過濾、滅菌獲得色澤金黃透亮、有成熟水果香與酒香、酸甜苦味均衡的青稞格瓦斯。所得青稞格瓦斯白利度12.9%、還原糖含量7.75 g/100 mL、酸度1.76 g/L、pH為4.51、酒精度2.10%、氨基氮含量12.26 mg/100 mL。利用SPME-GC-MS技術初步認定乙醇、異戊醇、苯乙醇、乙酸異戊酯等為格瓦斯的主要揮發性風味成分。但研究未對青稞格瓦斯的調配、澄清、滅菌、貯藏工藝做進一步探討，在后期工作中需加以完善。

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Preparation of a Highland barely kvass and volatile flavor components analysis

LI Yu-bin1, WU Hua-chang2, XIAO Meng2, TANG Hong-mei2,YAN Meng-qin2, LIU Yang2, DENG Jing2*

1(Bioengineering Department of Sichuan University of Science & Engineering, Zigong 643000, China) 2(Provincial Key Laboratory of Cooking Science of Sichuan Tourism University, Chengdu 610000, China)

In this study, Highland barley was used as raw material to make kvass, the process of fermentation was optimized by single-factor and orthogonal experiment, then volatile flavour components of barley kvass were identified by using head space solid-phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS). Results showed that: Compared with the control group, the soluble β-glucan content of Highland barley juice with killing enzyme treatment improved 36.08%; The optimal fermentation condition of kvass was Highland barley juice concentration 14%, bacteria agent addition 1.6 g/L, added proportion (bread yeast∶lactic acid bacteria) 1∶1, temperature 30 ℃, time 10 h. After 10 h aging, the total acidity of Highland barley kvass was 1.76 g/L, alcohol degrees 2.13%, β-glucan content 13.32 g/L, amino nitrogen content 12.26 mg/100 mL. The main volatile flavour components of Highland barley kvass were ethanol (53.46%), isoamyl alcohol (13.08%), alcohol (6.09%), isoamyl acetate (3.17%). The beverage was golden and bright, mature fruit aroma and bouquet, bitter sweet and sour balance.

Highland barley; kvass; fermentation; aging; volatile flavour components

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701017

碩士研究生(鄧靜教授為通訊作者，E-mail:79190096@qq.com)。

四川省科技廳(2013JY0084)；四川省科技廳(2016FZ0027)；四川省大學生創新創業計劃(201511552036)；四川理工學院研究生創新基金(y2015012)

2016-04-01，改回日期：2016-07-19