牦牛乳乳糖酶解及其預熱處理條件優化

管聲，梁琪*，宋雪梅，黃紹海，張炎，文鵬程

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅雪頓牦牛乳業股份有限公司，甘肅 蘭州，730050)

牦牛乳乳糖酶解及其預熱處理條件優化

管聲1,2，梁琪1,2*，宋雪梅1,2，黃紹海3，張炎1,2，文鵬程1,2

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州，730070) 3(甘肅雪頓牦牛乳業股份有限公司，甘肅 蘭州，730050)

針對牦牛乳熱處理和乳糖酶解問題，采用夏河鮮牦牛乳為原料，以乳糖水解速率(V0)和微生物數量為評價指標，探究牦牛乳乳糖酶解預熱處理參數，并以乳糖水解率為目標對酶解條件進行優化。結果表明：牦牛乳經適宜條件熱處理能明顯增強外源乳糖酶酶解活性，65 ℃熱處理5 min后酶解乳糖，V0升高49.0%。結合實際生產需求，乳糖酶解前對牦牛乳分別進行高溫短時和低溫長時巴殺處理，確定預熱處理參數為85 ℃，13 s；優化得到酶解條件為：酶解溫度39 ℃，酶解時間2.4 h，酶添加量2.4 u/mL，乳糖水解率達(79.7±0.9)%，相比未經熱處理牦牛乳中同等條件，酶解率升高11.2%～14.0%，且水解率達標(≥70%)時間縮短0.75 h。

牦牛乳；熱處理；乳糖；酶解；優化

牦牛乳是青藏高原獨特的優質乳源，蛋白質、脂肪、礦物質等營養成分含量均高于普通牛乳，乳糖平均含量為5.03%，較荷斯坦牛乳高約10%[1-2]。我國是乳糖不耐癥人群大國，健康成年人乳糖不耐受率為92%，兒童乳糖不耐癥發生率也高達30%以上[3]，但國內乳品工業中液態白乳低乳糖化率極低，優質乳源在傳統加工中未能發揮其優勢和價值，因此，探索牦牛乳低乳糖化技術，提升其營養價值，發揮青藏高原地區牦牛乳優質潛力極為重要。

酶水解法是目前牛乳低乳糖化最常用的方法[4-5]。荷斯坦牛乳低乳糖化過程中蛋白組成、含量[6]以及金屬離子環境[7]等因素對外源乳糖酶酶解活性影響顯著。牦牛乳中酪蛋白含量及其膠束結構以及乳球蛋白、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Na+、K+等成分含量與荷斯坦牛乳間差異[8-9]所導致的二者加工特性不容忽視。

作為液態乳加工中不可或缺的關鍵環節，熱處理過程會導致原料乳發生一系列物理化學變化，例如形成不溶性復合物而產生鹽析，蛋白質發生降解或與其他組分反應等[10-11]，上述變化很可能對乳糖酶解過程產生影響。本試驗以甘肅夏河藏區鮮牦牛乳為原料，探究熱處理對外源乳糖酶酶解活性的影響，并以乳糖水解速率(V0)為紐帶將原料乳熱處理與酶解乳糖過程相聯系，確定牦牛乳乳糖酶解預熱處理參數，并在此基礎上，對乳糖酶解條件進行了優化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮牦牛乳采自甘南夏河健康牦牛；鮮荷斯坦牛乳采自甘肅農業大學奶牛場；β-半乳糖苷酶(來源于乳酸克魯維酵母3 000 u/g)哈爾濱美華生物科技公司；其他試劑均為國產分析純。

NRY200恒溫搖床，上海南榮實驗室設備有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HWS26 電熱數顯恒溫水浴鍋，上海-恒科科技有限公司；SP-754C紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；GZX-GF101 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫療器械有限公司；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 牦牛乳熱處理對外源乳糖酶酶解活性的影響

取鮮牦牛乳30 mL，分別在65、75、85 ℃下熱處理5 min后迅速降溫至38 ℃，添加乳糖酶(1 u/mL)進行恒溫酶解，并測定乳樣中前20 min內每10 min葡萄糖生成量，以葡萄糖增量即乳糖水解速率(V0)大小判定乳糖酶酶解活性。終止酶解反應時，向乳中加入等體積12% TCA溶液[12]。相同處理條件下，荷斯坦牛乳為對照組。

1.2.2 牦牛乳乳糖酶解預熱處理參數確定

取30 mL鮮牦牛乳，其他條件不變，分別考察溫度(70～85 ℃)和時間(8～23s)條件下熱處理對乳中微生物數量及乳糖水解速率(V0)的影響，確定最佳預熱處理參數。

1.2.3 牦牛乳乳糖酶解單因素試驗

取30 mL鮮牦牛乳，熱處理后迅速降至預定溫度，無菌添加乳糖酶，固定其他因素，分別探究酶解溫度、酶解時間、酶添加量對乳糖水解率的影響；由于乳糖酶最適pH6.5與牦牛乳pH非常接近[13]，故不進行pH優化。

1.2.3.1 酶解溫度對乳糖水解率的影響

酶添加量為2 u/mL，酶解時間為2.5 h，在酶解溫度分別為28、33、38、43、48 ℃條件下測定乳糖水解率。

1.2.3.2 酶解時間對乳糖水解率的影響

酶解溫度為38 ℃，酶添加量為2 u/mL，酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后測定乳糖水解率。

1.2.3.3 酶添加量對乳糖水解率的影響

酶解溫度為38 ℃，酶解時間為2.5 h，酶添加量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 u/mL條件下測定乳糖水解率。

1.2.4 響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，依照Box-Benhnken中心組合試驗設計原理，以A(溫度)、B(時間)和C(E/S)為自變量，進行乳糖酶解條件優化。試驗因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表

1.2.5 測定方法

葡萄糖含量：參照GB/T 16285—2008《食品中葡萄糖的測定》；菌落總數：參照GB4789.2—2010《食品微生物學檢測菌落總數測定》；乳糖水解率：參照碘量法[14]測定；乳糖含量：參照SN/T 0871—2012《出口乳及乳制品中乳糖的測定方法》。

1.2.6 數據處理

利用Design Expert 8.0.6軟件和SPSS 20.0軟件對試驗數據進行分析處理。

2 結果分析

2.1 牦牛乳熱處理對外源乳糖酶酶解活性的影響

由圖1可知，牦牛乳與荷斯坦牛乳經65、75、85 ℃熱處理5 min后，乳糖水解速率V0均升高，牦牛乳中V0增量(26.5%～49.0%)約為荷斯坦牛乳V0增量(9.0%～18.0%)的3倍，說明不同乳源牛乳熱處理對外源乳糖酶的激活效應存在差異，且牦牛乳中該效應表現更為顯著，65 ℃熱處理5 min后V0可達1.46 μmolglucose/(mL·min)。JIMéNEZ等[12]發現，此激活效應主要是由于乳清蛋白尤其是β-乳球蛋白受熱變性釋放出大量活性巰基所致。同時，經方差分析表明，熱處理程度對牦牛乳V0影響顯著(P<0.05)。以上結果表明，酶解乳糖前，對牦牛乳采取預熱處理，可以有效提高乳糖酶解效率。

圖1 熱處理對荷斯坦牛乳和牦牛乳中乳糖水解速率(V0)的影響Fig.1 The effect of heating on the lactose hydrolysis rate (V0) of holstein and yak milk

2.2 牦牛乳乳糖酶解預熱處理方式的確定

目前液態乳常用熱處理方式主要有預熱殺菌、巴氏殺菌、超巴氏殺菌和UHT滅菌4種[15]。從保護牦牛乳營養成分和感官品質考慮，本試驗選擇如表2所示的不同條件巴氏殺菌進行牦牛乳預熱處理。

表2 不同形式巴氏熱處理對牦牛乳乳糖水解

研究顯示，原料乳經低溫長時和高溫短時巴氏殺菌后酶解乳糖，乳糖水解速率V0無顯著差異(P>0.05)，但相比原料乳有顯著升高(P<0.05)。結合實際生產需求，選擇高溫短時巴殺作為牦牛乳乳糖酶解預熱處理方式。

2.3 牦牛乳乳糖酶解預熱處理參數的確定

不同熱處理條件下，乳中微生物數量變化如表3所示。經方差分析表明，熱處理溫度和時間對微生物數量影響顯著(P<0.05)。70、75、80、85 ℃下持續8 s，均可使菌落總數符合我國巴氏乳安全標準[16]。

表3 不同熱處理條件下微生物數量(對數值)的變化情況

原料乳經不同條件巴殺處理后酶解乳糖，V0變化如圖2。單因素方差分析顯示，熱處理時間和溫度對V0均影響顯著(P<0.05)。在較短熱處理時間內，V0隨熱處理強度增大，呈上升趨勢，85 ℃熱處理13 s時V0達最大，為1.51 μmolglucose/(mL·min)，原因是乳清蛋白變性程度隨熱處理溫度升高而增大[17]，在較高溫度(85 ℃)下乳清蛋白完全變性，釋放出大量活性巰基使乳糖酶活力明顯被激活[12]。延長熱處理時間，V0呈下降趨勢，這可能是由于變性乳清蛋白與酪蛋白膠粒開始發生聚合，使得乳中活性巰基濃度下降，酶激活效應減弱[18]。因此，在乳中菌落總數符合我國巴氏乳安全標準[16]前提下，85 ℃、13 s更適宜作為乳糖酶解預熱處理參數。

圖2 不同條件熱處理對乳糖水解速率(V0)的影響Fig.2 The effect of different conditions of heat treatments on the lactose hydrolysis rate(V0)

2.4 牦牛乳乳糖酶解單因素試驗

2.4.1 溫度對乳糖水解率的影響

由圖3可知，當酶解溫度由28 ℃升高到38 ℃乳糖水解率呈增大趨勢。這是因為，在乳糖酶最適溫度以下升高溫度可有效促進酶分子運動，增強與乳糖結合能力，促使水解率不斷升高[19]。大于38 ℃，隨著溫度上升，水解率快速下降，這是由于，溫度過高使乳糖酶失去部分活性，不能充分酶解乳糖。因此，確定乳糖酶解最適溫度為38 ℃。

圖3 溫度對乳糖水解率的影響Fig.3 The effect of different temperatures on the lactose hydrolysis

2.4.2 時間對乳糖水解率的影響

由圖4可知，隨著酶解時間延長，β-半乳糖苷酶與乳糖反應愈加充分，使得水解率不斷上升。酶解2.5 h，水解率>70%，可以滿足乳糖不耐癥患者需求[20]。過度延長酶解時間，會延長生產周期，也可能增加原料乳受污染風險，酶解時間以2.5 h為佳。

圖4 水解時間對乳糖水解率的影響Fig.4 The effect of time on the lactose hydrolysis

2.4.3 酶添加量對乳糖水解率的影響

圖5 酶添加量對乳糖水解率的影響Fig.5 The effect of enzyme concentration on the lactose hydrolysis rate

由圖5可知，當酶添加量由0.5 u/mL增大至2 u/mL，水解率呈顯著(P<0.05)上升趨勢。因為酶用量增大過程中，酶分子同底物結合幾率增大，水解率增大。當酶添加量大于2 u/mL后，水解率趨于穩定(P>0.05)。因為酶添加量較大時，酶分子已經結合了底物的大部分酶切位點，繼續增加酶用量對酶解反應的貢獻減弱。從提高乳糖酶利用率考慮，確定酶添加量為2 u/mL，此時，水解率為76.3%。

2.5 響應面優化牦牛乳乳糖酶解條件

2.5.1 響應面優化設計及試驗結果

根據Box-Behnken設計原理，進行17組乳糖酶解試驗，結果見表4。利用Design Expert 8.0.6軟件對所得數據進行回歸分析，得到二次多項回歸方程：

Y=76.44+1.55A+1.88B+4.75C+2.15AB+2.25AC-0.50BC-9.25A2-1.35B2-0.69C2。

2.5.2 回歸模型的建立和分析

表4 響應面優化設計及試驗結果

表5 乳糖水解率回歸模型方差分析表

2.5.3 回歸模型的驗證

牦牛乳乳糖酶解最優條件為：溫度38.81 ℃、時間2.44 h、酶添加量2.44 u/mL。此條件下，預測水解率達80.2%。根據實際試驗條件修訂酶解條件為：溫度39 ℃、時間2.4 h、酶添加量2.4 u/mL，并進行驗證試驗(n=3)測得乳糖水解率為(79.7±0.9)%，與預測值非常接近，說明該試驗模型可行性較高，優化結果可靠。

2.6 優化工藝驗證試驗

牦牛乳熱處理(85 ℃，13 s)前后，測定乳糖酶解反應底物(乳糖)和產物(葡萄糖)含量。如表6所示，熱處理牦牛乳中乳糖含量與原料乳中相當，二者葡萄糖含量均可忽略(<0.01 g/100mL)，表明適宜條件熱處理對牦牛乳中乳糖無直接影響。這與MESSIA[21]等關于低乳糖荷斯坦牛乳生產加工特性的研究結果相似。

表6 預熱處理對牦牛乳中乳糖與葡萄糖含量影響

表7 熱處理乳與原料乳中乳糖水解效果比較

從表7可知，以本試驗所得最佳條件酶解未經熱處理牦牛乳中乳糖，測得乳糖水解率為(67.1±0.5)%，相比熱處理乳(85 ℃、13 s)水解率低約11.2%～14.0%。該差異值也高于GREENBERG[22]與KOSIKOWSKI[23]報道的巴氏殺菌處理對荷斯坦牛乳乳糖水解率提升量(5.0%～8.0%)。為進一步客觀評價該優化工藝，根據低乳糖乳制品需求[22]，本試驗設定目標水解率為70%，同等酶解條件(酶添加量2.4 u/mL，酶解溫度39 ℃)下，未經熱處理牦牛乳乳糖水解率≥70%至少需要2.65 h，然而，按照本試驗優化工藝進行酶解處理，僅需 1.9 h，比前者用時縮短0.75 h，顯著提高了乳糖酶解環節生產效率。

3 討論

研究結果表明，乳糖水解速率較乳糖水解率能更加客觀、準確地反映出外源乳糖酶在牦牛乳中活性表現情況。牦牛乳經熱處理后酶解乳糖，乳糖水解速率最大時外源乳糖酶酶解活性表現最強，說明此熱處理乳更適宜進行乳糖酶解。作為乳糖酶解效果的直觀表現，以乳糖水解率作為指標優化乳糖酶解條件，更加貼近實際生產需求。同時，通過優化工藝驗證試驗將牦牛乳經適宜熱處理后乳糖水解速率(V0)增量有效轉換為更貼近實際生產的衡量指標——乳糖水解率與水解率達標(≥70%)時間，實現了整體研究評價標準的回歸與統一。

4 結論

牦牛乳熱處理對外源乳糖酶酶解活性具有顯著激活效應，85、75、65 ℃熱處理5 min后酶解乳糖，乳糖水解速率增量達26.5%～49.0%，約為荷斯坦牛乳3倍。依照實際生產條件，優化牦牛乳乳糖酶解預熱處理參數為85 ℃，13 s，乳糖酶解條件為：溫度39 ℃，時間2.4 h，酶添加量2.4 u/mL，乳糖水解率可達(79.7±0.9)%。驗證試驗發現，較未熱處理牦牛乳中同等條件酶解乳糖，此優化工藝顯著提高了乳糖酶解效率，有效縮短了酶解時間。

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Optimization of enzymatic hydrolysis of yak milk lactose and preheat treatment process

GUAN Sheng1,2, LIANG Qi1,2*, SONG Xue-mei1,2, HUANG Shao-hai3,ZHANG Yan1,2, WEN Peng-cheng1,2

1(Food Science and Engineering Department of Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)2(Functional Dairy Product Engineering Laboratory of Gansu, Lanzhou 730070, China)3(Lanzhou Xuedun Organism Dairy Produce Co. Ltd., Lanzhou 730050, China)

For a range of issues about heat treatment and lactose enzymolysis of yak milk, using yak milk derived from xiahe town Gansu province as raw material, taking microorganisms and lactose hydrolysis rate (V0) as assessment index, the preheat treatment conditions of lactose enzymolysis were determined. The conditions of lactose enzymolysis were optimized with lactose hydrolysis rate (V0) as index. The results showed that optimal heat treatment of yak milk significantly enhanced exogenous lactase enzyme activity. After enzymatic hydrolysis of lactose at 65 ℃ for 5 min, theV0was up to 49.0%. According to the requirement of actual production, pasteurized treatments using low temperature long time (LTLT) and high temperature short time (HTST) respectively were performed before lactose enzymolysis of yak milk, the condition for lactose enzymolysis was determined as 85 ℃ for 13 s. Response surface analysis (RSA) was applied to optimize the conditions of lactose enzymolysis on the foundation of single-factor experiment. The condition of lactose enzymolysis were determined as follows: enzymolysis temperature was 39 ℃, enzymolysis time was 2.4 h, amount of enzyme was 2.4 u/mL. The lactose hydrolysis rate reached 79.7%±0.9% under the optimized conditions, which was 11.2%-14.0% comparatively improvement comparing with the raw material in the same condition, while the time to meet the standard requirements (≥70%) has been reduced by 0.75 h.

yak milk; heat treatment; lactose; enzymolysis; optimize

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701020

碩士研究生(梁琪教授為通訊作者,E-mail：liangqi@gsau.edu.cn)。

國家自然科學基金地區科學基金項目-牦牛乳硬質干酪脂肪酸的構成特征及氧化調控機制研究(31660468)；甘肅省高等學校科研項目(2014A-061)

2016-08-11，改回日期：2016-09-08