吐溫40作為谷氨酸發酵促進劑的機制研究進展

賴木蘭，萬方，朱薔云，陳雪嵐

(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌，330022)

吐溫40作為谷氨酸發酵促進劑的機制研究進展

賴木蘭，萬方，朱薔云，陳雪嵐*

(江西師范大學 生命科學學院，江西 南昌，330022)

吐溫(Tween)是一種安全的非離子型表面活性劑，被廣泛應用于乳化劑、油類物質的增溶劑和微生物發酵促進劑等。其中Tween 40被發現可以明顯提高谷氨酸棒桿菌等棒桿菌屬產谷氨酸的量，因此引起了相關科研工作者對其作用機制的關注。文中主要對Tween 40誘發谷氨酸棒桿菌高產谷氨酸的機制進行綜述，并分析研究過程中亟待解決的問題及發展趨勢。

吐溫40；谷氨酸；谷氨酸棒桿菌；作用機制

吐溫(Tween)化學名為聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，簡稱聚山梨酯，為兩親性物質，其分子中同時含有親水基團(聚氧乙烯基)和親油基團(脂肪酸鏈和烷基)；在水溶液中難解離，屬于非離子型表面活性劑[1]。由于Tween的特殊性質，使其作為乳化劑[2-4]、增溶劑[5-6]以及濕潤劑[7]等在石油、化工、塑料、機械、涂料、皮革、化妝品等工業生產中廣泛應用。

根據脂肪酸鏈的不同，Tween主要分為Tween 20(聚環氧乙烷山梨糖醇單月桂酸酯)、Tween 40(聚氧乙烯山梨醇酐棕櫚酸酯)、Tween 60(聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯)和Tween 80(聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯)，其中Tween 40和Tween 80作為一種能顯著提高目的產物產量的發酵促進劑常用于發酵工程中[8]。如LUO等[9]利用EscherichiacoliW3110-ZDrr重組菌進行發酵，當培養基存在Tween 80時，色氨酸產量提高到原來的兩倍，達25.5 g/L；龍輝等[10]在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum)發酵生產L-異亮氨酸對數期中后期(18h)添加Tween 80，單位細胞產酸的能力提高13.3%；在抗生素發酵中，朱鳳等[11]在螺旋霉素發酵過程中加入Tween 80，其螺旋霉素產量提高11.9%，其發酵效價達28 176 U/mL；曹艷[12]在谷氨酸發酵過程中添加Tween 40，使得谷氨酸產量達到80 g/L。由此可見Tween給利用微生物生產的發酵工業帶來了巨大的效益。

C.glutamicum作為一類遺傳背景清楚且不產毒素的菌株，被廣泛應用于各種氨基酸的生產并相應地作為試驗對象進行了各種生理生化機制的研究。其中，Tween 40促進該菌株產谷氨酸的機制也得到逐步的剖析。從目前的文獻報道分析，對其作用機制的認識主要經歷了滲透模型、谷氨酸轉運蛋白的結構改變機制以及谷氨酸合成網絡的酶活調控機制3種。本文主要介紹Tween 40促進C.glutamicum分泌谷氨酸的3種機制，并結合本課題組的研究結果分析亟待解決的問題及發展趨勢。

1 滲透模型

滲透模型認為在外界條件的誘導下，通過改變細胞表面結構的通透性，使谷氨酸能夠通過滲透作用分泌到胞外，同時胞內谷氨酸的含量降低，解除了反饋抑制，增加了谷氨酸合成。細胞表面結構的改變包括細胞壁結構和細胞膜磷酯成分的改變，下面分別就Tween 40對這兩種結構的改變與促進谷氨酸高產的相關性進行介紹。

1.1 細胞壁結構的改變

C.glutamicum細胞壁主要是由糖肽化合物聚合而成的多層網狀大分子結構所組成，其細胞壁外層另有一層分支菌酸層，它通過阿拉伯半乳聚糖以共價鍵的形式與肽聚糖層緊緊相依，成為了細胞的第一道滲透屏障。分支菌酸層含有大量的糖脂，如海藻糖分支菌酸脂等。GEBHARDT等[13]構建海藻糖缺失菌株LP△treS△otsA△treY，使分支菌酸的合成受阻，發現其賴氨酸、谷氨酸產量增加。由此說明分支菌酸層在氨基酸分泌中具有一定的滲透屏障的作用。HASHIMOTO等[14]通過氣象色譜-質譜(GC-MS)分析發現在Tween 40誘導的條件下，C.glutamicum產谷氨酸的量得到提高，而其分支菌酸的含量降低到原來的60%。因此認為Tween 40可以通過影響分支菌酸層的合成，從而影響細胞壁的滲透性，使谷氨酸的分泌量增加。

1.2 細胞膜磷酯成分的改變

細胞膜是谷氨酸分泌到胞外所必須通過的一道屏障，細胞膜的完整性對谷氨酸的分泌有顯著影響。脂類是細胞膜重要組成成分，其由dtsR編碼的乙酰-CoA羧化酶以及其他一系列酶催化反應形成，脂類成分的改變會影響細胞的通透性。KUMAR等[15]在C.glutamicum發酵時添加Tween 40，并監測DtsR蛋白的表達量，結果發現隨著Tween 40添加量的增加，DtsR表達量呈明顯的下降趨勢，谷氨酸的產量卻有顯著的提高。究其原因，發現DtsR合成受阻會改變細胞膜磷脂成分，從而提高了細胞膜分泌谷氨酸的閥值。為了探究Tween的作用靶點是細胞膜，NAMPOOTHIRI等[16]分別過表達與磷脂合成有關的基因，包括acp、fadD15、cma、cls、pgsA、cdsA和plsC等，發現重組菌的磷脂的組成成分發生了改變，且無Tween誘導時，谷氨酸的產量由原始菌的0.2 mmol/L分別變為4.8、0.3、0.3、7.1、3.6、3.8和0 mmol/L，這結果顯示谷氨酸的分泌受到細胞膜磷脂組成成分的強烈影響。當原始菌受1.5 mg/mL Tween 60或Tween 40誘導時，谷氨酸的產量可以達到91 mmol/L；當上述重組菌分別受1.5 mg/mL的Tween誘導時，過表達acp、fadD15或cdsA的重組菌的谷氨酸的積累反而降低了，且acp過表達使得谷氨酸產量顯著降低，降為了24 mmol/L；而過表達cma、cls或plsC的重組菌積累谷氨酸的能力增加，谷氨酸產量均超出100 mmol/L，其中過表達plsC的重組菌谷氨酸產量達到109 mmol/L。這些現象作者認為Tween依賴的谷氨酸分泌可能是通過激活或失活與磷脂合成相關的基因，從而改變細胞膜磷酯組成，進而影響谷氨酸的產量。

2 谷氨酸轉運蛋白結構改變機制

滲透模型使人們普遍認為谷基酸的分泌即僅僅是跨膜擴散機制，但此模型無法解釋在胞外大量積累谷氨酸而胞內谷氨酸濃度不受滲透作用的影響。在C.glutamicum中，賴氨酸、異亮氨酸以及蘇氨酸等都是由相應的輸送載體所介導輸送至細胞外。由此科研工作者推斷，細胞膜上可能存在一種轉運谷氨酸的蛋白質。NAKAYAMA等[17]對C.glutamicumΔNCgl1221菌株給予誘導劑(Tween 40，青霉素等)處理時，發現其谷氨酸分泌受阻，胞內谷氨酸積累，這結果實際上否定了滲透模型；若過表達NCgl1221，則胞外谷氨酸積累幅度大量提高；作者將C.glutamicum的NCgl1221進行序列比對分析，發現它與E.coil的一種機械敏感性通道膜蛋白YggB具有很高的同源性。HASHIMOTO等[18-19]通過電生理學分析確定NCgl1221是一種機械敏感性通道膜蛋白，并確認其能特異性地轉運谷氨酸。YAO等[20]將NCgl1221與綠色熒光蛋白進行融合表達，確定了NCgl1221蛋白位于細胞膜上且NCgl1221是一種C端在胞質內的四次跨膜蛋白質；當誘導劑Tween 40的存在時，脂肪酸的合成會因為受到抑制而改變膜的脂質組成，這種改變使膜的張力及滲透性發生改變的同時也使機械敏感性離子通道膜蛋白——NCgl1221谷氨酸轉運蛋白的空間構像也發生了相應的改變，而這種改變使之運輸谷氨酸到細胞外的能力大幅提高，從而提高谷氨酸的產量。這個機制能解釋滲透模型所不能回答的問題。雖然以上研究否定了滲透模型，但與NAMPOOTHIRI等研究結果不沖突，是其研究結果的深入，正是細胞膜磷脂成分的改變等而導致NCgl1221谷氨酸轉運蛋白的空間構像發生變化，從而促進了谷氨酸的分泌。

圖1 谷氨酸棒桿菌中谷氨酸的生物合成途徑Fig.1 The biosynthetic pathways of glutamate in Corynebacterium glutamicum

3 谷氨酸合成網絡的酶活調控機制

目前報道Tween 40影響谷氨酸合成網絡的酶活調控包括α-酮戊二酸脫氫酶復合物(α-oxoglutarate dehydrogenase complex，ODHC)的酶活調控和丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC)的酶活調控。

3.1 α-酮戊二酸脫氫酶復合物(ODHC)的酶活調控

谷氨酸的生物合成網絡主要包括糖酵解途徑(glycolytic pathway，EMP)，三羧酸循環途徑(tricarboxylic acid cycle，TCA)，乙醛酸循環途徑以及回補途徑等，如圖1所示。α-酮戊二酸作為谷氨酸的前體物質是三羧酸循環途徑的中間代謝產物，其可通過ODHC催化形成琥珀酰-CoA，也可在谷氨酸脫氫酶的催化下形成谷氨酸。因此，ODHC的表達如受到抑制，則代謝流將集中流向谷氨酸合成途徑[21-22]。

在谷氨酸棒狀桿菌中，ODHC是由3種亞基酶組成的復合物，這3種亞基酶分別是odhA編碼的α-酮戊二酸脫氫酶，sucB編碼的二氫硫辛酰胺琥珀酰轉移酶以及lpd編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶。KIM等[23]發現在Tween 40存在的情況下，ODHC的活性下降，谷氨酸的產量會得到提高。可見Tween 40能降低ODHC的活性從而提高谷氨酸產量。

ODHC的活性受OdhI磷酸化的影響，其主要機制是未磷酸化的OdhI可以通過其FDH區域與ODHC中的OdhA亞基結合，從而抑制ODHC的活性；蛋白激酶G(PknG)可以對OdhI的第14位蘇氨酸進行磷酸化，磷酸化的OdhI可以從OdhA上脫離下來，從而解除對ODHC的抑制[24]。SCHULTZ等[25]發現除PknG外，還有3種磷酸激酶可以磷酸化OdhI，即PknA、PknB、PknL，但PknB起主要作用；作者同時發現由ppp編碼的磷酸蛋白磷酸酶Ppp也可將磷酸化的OdhI去磷酸化。綜上所述，ODHC的活性受到OdhI的磷酸化狀態的調控。但是Tween 40是如何降低ODHC的活性？是否也對OdhI磷酸化水平有影響？為了探索Tween 40等誘導劑抑制ODHC酶活性的具體機制，Kim等[26]通過Western Blotting定量分析在Tween 40存在的條件下，谷氨酸大量生產時其胞內OdhI的磷酸化水平。結果發現，在Tween 40誘導的條件下，磷酸化和未磷酸化的OdhI均有所提高，但未磷酸化的OdhI明顯高于磷酸化的OdhI。由此可見，Tween 40促進谷氨酸高產的可能原因是其可以增加未磷酸化的OdhI的含量從而抑制ODHC的活性，最終增加了谷氨酸的產量。

3.2 丙酮酸羧化酶的酶活調控

丙酮酸羧化酶(PC)是三羧酸循環回補途徑中的關鍵合成酶，其催化丙酮酸合成草酰乙酸。此回補途徑還可以通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenopyuvate carboxylase, PEPC)催化磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸，如圖1所示。在TCA循環中，草酰乙酸和乙酰-CoA合成為α-酮戊二酸的前體物質檸檬酸，而α-酮戊二酸是谷氨酸的前體物質，因此草酸乙酰合成的增加則能提高谷氨酸的合成。PETERS等[27]通過過表達編碼PC基因已證實可以提高谷氨酸的積累。SHIRAI等[28]建立葡萄糖13C標記的代謝通量分析，通過氣相色譜質譜法實時測定胞內蛋白質氨基酸13C豐度，分析在Tween 40的誘導下C.glutamicum在谷氨酸生產過程中兩條回補途徑所扮演的角色。結果表明在生長期，由PC催化丙酮酸合成草酰乙酸的途徑代謝通量幾乎為零，由PEPC催化的磷酸烯醇式丙酮酸合成草酰乙酸的途徑代謝通量為38%；在谷氨酸生產期，PC催化的途徑代謝通量明顯增加達到56%，而由PEPC催化的途徑代謝通量則無明顯變化。這與HASEGAWA等[29]在Tween 40誘導條件下，對丙酮酸支點各酶活進行測定，發現PC的酶活逐步提高至在15 h達到最高酶活，提高了1.4倍；而PEPC酶活無明顯變化這一實驗結果吻合。由此可見，在Tween 40誘導谷氨酸生產過程中，PC扮演著至關重要的角色，其酶活提高則此回補途徑代謝通量也明顯增加，促使草酰乙酸增加的同時也為谷氨酸的合成提供更多的前體物質——α-酮戊二酸。以上研究結果表明，在菌株不同生長階段，Tween 40可能特異地調控PC的酶活，在谷氨酸生產期，Tween 40能夠激活PC酶，最終誘導谷氨酸的高產。以上機制的揭示進一步補充了Tween 40能提高C.glutamicum合成谷氨酸的本質。

4 問題與展望

Tween 40作為發酵促進劑，對其引發C.glutamicum高產谷氨酸的機制是經歷了逐步剖析的過程。從在Tween 40作用下細胞壁及細胞膜的變化與谷氨酸高產的關聯、谷氨酸運輸蛋白的發現及在Tween 40作用下其空間構像發生的變化與谷氨酸高產的關聯、在Tween 40作用下谷氨酸合成途徑中多種酶活性的變化與谷氨酸高產的關聯等多方面的研究，獲得了主要包括滲透模型(雖然滲透模型已被否認，但細胞膜磷脂成分的改變卻與谷氨酸轉運蛋白結構的改變相關)、谷氨酸轉運蛋白結構的改變和谷氨酸合成網絡酶活的調控這些機制，也正是由于這些Tween 40引起的改變共同促進了谷氨酸的高產。同時，本課題組在敲除鈍齒棒桿菌(與谷氨酸棒桿菌同源性達到99%)谷氨酸運輸蛋白NCgl1221、研究Tween 40增加精氨酸(谷氨酸是精氨酸的前體物質)產量的機制時，發現一個新的現象，即磷酸戊糖途徑的基因zwf的轉錄水平大幅提高且相應胞內的NADPH積累增加[30]。因此，從以上Tween 40對微生物發酵的影響機制分析，認為依然存在需要進一步闡述的問題，包括(1)Tween 40與合成磷脂相關基因的作用靶點；(2)Tween 40如何降低ODHC的酶活，與OdhI磷酸化程度的關系，其磷酸化程度又是如何調控的；(3)Tween 40如何調控PC酶和PEPC酶活性；(4)Tween 40如何提高磷酸戊糖途徑的表達，從而提高NADPH的供應等。相信這些問題可以通過轉錄組、蛋白組學等手段進一步揭示，更全面系統地了解Tween 40誘發谷氨酸棒桿菌等棒桿菌屬高產谷氨酸本質，從而充分利用使其在微生物發酵工業領域發揮更大的作用。

[1] KERWIN B. Polysorbates 20 and 80 used in the formulation of protein biotherapeutics: structure and degradation pathways[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2008, 97(8): 2 924-2 935.

[2] BENJAMIN O, SILCOCK P, BEAUCHAMP J, et al. Emulsifying properties of legume proteins compared to β-lactoglobulin and Tween 20 and the volatile release from oil-in-water emulsions[J]. Journal of Food Sciences，2014, 79(10): E2 014-E2 022.

[3] GUTTOFF M, SABERI A, MCCLEMENTS D. Formation of vitamin D nanoemulsion-based delivery systems by spontaneous emulsification: factors affecting particle size and stability[J]. Food Chemistry, 2015, 171(15): 117-122.

[4] ERRAAMREFDDY V V, GHOST S. Influence of emulsifier concentration on nanoemulsion gelation[J]. Langmuir, 2014, 30(37): 11 062-11 074.

[5] SMART J, DUNKLEY S, TSIBOUKLIS J, et al. An evaluation of the adhesion of solid oral dosage form coatings to the oesophagus[J]. International Journal of Pharmaceutics. 2015, 496(2): 299-303.

[6] WONG T, SUMIRAN N. Oral calcium pectinate-insulin nanoparticles: influences of alginate, sodium chloride and Tween 80 on their blood glucose lowering performance[J]. The Journal of Pharmaceutics and Pharmacol, 2014, 66(5): 646-657.

[7] DESAI D, WONG B, HUANG Y, et al. Surfactant-mediated dissolution of metformin hydrochloride tablets: wetting effects versus ion pairs diffusivity[J]. Journal of Pharmaceutics Sciences, 2014, 103(3): 920-926.

[8] 秦海斌，張偉國. 金屬離子及添加表面活性劑對谷氨酸發酵的影響[J].食品工業科技, 2009，10：167-173.

[9] LUO W, HUANG J, ZHU X, et al. Enhanced production ofL-tryptophan with glucose feeding and surfactant addition and related metabolic flux redistribution in the recombinantEscherichiacoli[J]. Food Science and Biotechnology, 2013, 22(1): 207-214.

[10] 龍輝,徐國棟,寧義科,等.吐溫-80對L-異亮氨酸發酵的影響[C]. 國際氨基酸產業發展高峰論壇,2013.

[11] 朱鳳，陳長華，張琪. Tween 85對螺旋霉素發酵過程的影響[J].中國醫藥工業雜志2008，39(3):176-178.

[12] 曹艷. 利用代謝酶學和模型技術改善谷氨酸發酵的穩定性和糖酸轉化率[D].無錫：江南大學, 2013.

[13] GEBHARDT H, MENICHEN X, TROPIS M, et al. The key role of the mycolic acid content in the functionality of the cell wall permeability barrier in Corynebacterineae[J]. Microbiology, 2007, 153(5): 1 424-1 434.

[14] HASHIMOTO K, KAWASKI H, AKAZAWA K, et al. Changes in composition and content of mycolic acids in glutamate-overproducingCorynebacteriumglutamicum[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2006, 70(1): 22-30.

[15] KUMAR R S, MOORTHY I M, BASKAR R. Modeling and optimization of glutamic acid production using mixed culture ofCorynebacteriumglutamicumNCIM2168 andPseudomonasreptilivoraNCIM2598[J]. Preparative Biochemistry and Biotechnology，2013, 43(7): 668-681.

[16] NAMPOOTHIRI K,HOISCHEN C, BATHE B,et al.Expression of genes of lipid synthesis and altered lipid composition modulatesL-glutamate efflux ofCorynebacteriumglutamicum[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 58(1): 89-96.

[17] NAKAMURA J,HIRANO S,ITO H,et al.Mutations of theCorynebacteriumglutamicumNCgl1221 gene, encoding a mechanosensitive channel homolog,induceL-glutamic acid production[J].Applied and Environmental Microbiology,2007(14),73:4 491-4 498.

[18] HASHIMOTO K, NAKAMURA K, KURODA T, et al. The protein encoded by NCgl1221 inCorynebacteriumglutamicumfunctions as a mechanosensitive channel[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2010, 74(12): 2 546-2 549.

[19] HAHIMOTO K, MURATA J, KONISHI T, et al. Glutamate is excreted across the cytoplasmic membrane through the NCgl1221 channel ofCorynebacteriumglutamicumby passive diffusion[J]. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2012, 76(7): 1 422-1 424.

[20] YAO W, DENG X, LIU M, et al. Expression and localization of theCorynebacteriumglutamicumNCgl1221 protein encoding anL-glutamic acid exporter[J]. Microbiological Researches, 2009, 164(6): 680-687.

[21] KAWAHARA Y,Takahashi-fuke K,Shimizu E,et al.Relationship between the glutamate production and the activity of 2-oxoglutarate dehydrogenase inBrevibacteriumlactofermentum[J].Bioscience, Biotechnology and Biochemistry,1997,61(7):1 109-1 112.

[22] ASAKURA Y, KIMURA E, USUDA Y, et al. Altered metabolic flux due to deletion ofodhA causesL-glutamate overproduction inCorynebacteriumglutamicum[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(4): 1 308-1 319

[23] KIM J, HIRASAWA T, SATO Y, et al. Effect of odhA overexpressionand odhA antisense RNA expression on Tween-40-triggered glutamate production byCorynebacteriumglutamicum[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 81(6): 1 097-1 106.

[24] NIEBISCH A, KABUS A, Schults C, et al. Corynebacterial protein kinase G controls 2-oxoglutarate dehydrogenase activity via phosphorylation status of the OdhI protein[J]. Biological Chemistry, 2006, 281: 12 300-12 307.

[25] SCHULTZ C, NIEBISCH A, SCHWAIGER A, et al. Genetic and biochemical analysis of the serine/threonine protein kinases PknA, PknB, PknG and PknL ofCorynebacteriumglutamicum: evidence for non-essentiality and for phosphorylation of OdhI and FtsZ by multiple kinases[J]. Molecular Microbiology, 2009, 74: 724-741.

[26] KIM J, HIRASAWA T, SAITO M, et al. Investigation of phosphorylation status of OdhI protein during penicillin-and Tween 40-triggered glutamate overproduction byCorynebacteriumglutamicum[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 91(1): 143-151.

[27] PETERS-WENDISCH P G, SCHIEL B, Wendisch VF, et al. Pyruvate carboxylase is a major bottleneck for glutamate and lysine production byCorynebacteriumglutamicum[J]. Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology, 2001, 3(2): 295-300.

[28] SHIRAI T, FUJIMURA K, FURUSAWWA C, et al. Study on roles of anaplerotic pathways in glutamate overproduction ofCorynebacteriumglutamicumby metabolic flux analysis[J]. Microbial Cell Factories, 2007, 6(1): 19-30.

[29] HASEGAWA T, HASHIMTO K I, KAWAKI H, et al. Changes in enzyme activities at the pyruvate node in glutamate-overproducingCorynebacteriumglutamicum[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2008, 105(1): 12-19.

[30] CHEN M L, CHEN X L, WAN F, et al. Effect of Tween 40 and DtsR1 onL-arginine overproduction inCorynebacteriumcrenatum[J]. Microbial Cell Factories, 2015, 14:119-129.

Researches on the mechanism of Tween 40-triggered glutamate overproduction

LAI Mu-lan, WAN Fang, ZHU Qiang-yun, CHEN Xue-lan*

(School of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022,China)

Tween, as a kind of safe nonionic surfactant, has been widely used in emulgator, solubilizer of oily substances, accelerant of microbial fermentation, etc. Among them, Tween 40 was found to significantly improve the yield ofCorynebacteriumglutamicum-producing glutamate, which caused the related researchers to focus on its mechanism. In this article, the research advances on Tween 40-triggered glutamate overproduction byCorynebacteriumglutamicumwere mainly discussed, and problems demanding prompt solution in research process and development trend were analyzed.

Tween 40; glutamate;Corynebacyeriumglutamicum; mechanism

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701046

學士(陳雪嵐教授為通訊作者,E-mail: xuelanchen162@163.com)。

國家自然科學基金(31360219)；江西省自然科學基金(2015BAB)

2016-06-05，改回日期：2016-07-25