PHH3在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達及其意義

韓換 蔣慧 鄭建明

·論著·

PHH3在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤中的表達及其意義

韓換 蔣慧 鄭建明

目的 檢測磷酸化組蛋白H3(PHH3)在胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(PNENs)中的表達，探討其對PNENs病理分級的意義。方法 回顧性分析2000年12月至2016年5月長海醫(yī)院收治的283例PNENs患者的臨床病理資料，將所有PNENs組織制成組織芯片，采用免疫組織化學方法檢測PHH3、Ki67的表達。通過繪制PHH3的受試者工作特征曲線，計算曲線下面積，確定PHH3對PNENs分級的臨界值。同時按國內(nèi)外公認標準依據(jù)Ki67對PNENs進行分級。分析并比較PHH3、Ki67兩種分級方法與PNENs臨床病理特征、預后及兩者之間的相關性。結果 本研究共納入PNENs患者283例，其中男性132例，女性151例，年齡16～78歲，平均(50±1)歲；功能性PNENs 44例，無功能性PNENs 239例；腫瘤直徑1.1～17 cm，平均(4.1±1.2)cm。PHH3法將283例患者分為G1級118例，G2級119例，胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(PNET)G3級38例，胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌(PNEC)G3級8例；Ki67法分為G1級127例，G2級116例，PNET G3級33例，PNEC G3級7例。兩種分級方法呈正相關關系(r=0.941，P<0.001)。PHH3表達及PNENs分級均與患者的年齡、性別及腫瘤有無功能、腫瘤部位無相關性(P值均>0.05)，而與腫瘤大小、組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期及患者預后呈正相關(P值均<0.05)。每例組織芯片免疫組織化學染色后觀察PHH3的平均時間為9 min，觀察Ki67的平均時間為45 min。結論 檢測PNENs的PHH3表達可對PNENs進行病理診斷分級和預后評估，較Ki67分級法更準確和更便捷。

胰腺腫瘤； 神經(jīng)內(nèi)分泌瘤； PHH3； 免疫組織化學

胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms, PNENs)是起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細胞的異質性腫瘤[1]。目前國內(nèi)對于PNENs的病理診斷分級標準主要依據(jù)2010版WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類指南[2]和2013版中國胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理診斷共識[3]。其中細胞增殖活性抗原Ki67是PNENs病理診斷分級的主要標志物，但存在計算方法繁雜、耗時、準確度低等缺點，因此迫切需要尋找方便、有效的新指標。磷酸化組蛋白 H3(phospho-histone H3，PHH3)是真核細胞染色質的主要構成蛋白之一，在有絲分裂期(M期)表達水平最高，是一種特異性核分裂標志物[4-5]。在擠壓變形組織中，PHH3可有效區(qū)別核碎裂或凋亡細胞。本研究采用組織芯片和免疫組織化學SP法檢測PNENs的PHH3、Ki67表達，分析并比較它們與臨床病理參數(shù)及預后的相關性，探討PHH3作為PNENs病理診斷分級指標的可行性。

資料與方法

一、臨床資料

收集2000年12月至2016年5月第二軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院收治的PNENs患者臨床病理資料，診斷符合上述WHO分類和國內(nèi)共識標準。入組標準：(1)首次診斷為PNENs；(2)術前未經(jīng)其他方式治療。排除標準：(1)混合性腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌(mixed adenoneuroendocrine carcinoma,MANEC)；(2)合并胰腺導管腺癌及其他類型腫瘤；(3)隨訪時間不足4個月者；(4)術前1周至術后1周內(nèi)圍手術期死亡者。所有病例均由兩位高年資病理醫(yī)師重新復片、診斷分級，同時根據(jù)腫瘤是否具有激素分泌功能和有無出現(xiàn)激素引起的臨床癥狀，將PNENs分為功能性和無功能性。

二、觀察細胞核分裂象

觀察核分裂象(mitotic figure，MF)的方法：(1)多在腫瘤近表部取組織塊，因近表部腫瘤新生能力強；(2)勿在切片的出血、壞死邊緣，血管內(nèi)皮細胞，淋巴濾泡生發(fā)中心等區(qū)域計數(shù)MF；(3)選取細胞染色清晰，無刀痕區(qū)域，采取一字回紋或上下螺紋式法觀察。選取10個高倍視野(high power field，HPF)對MF計總數(shù)。

三、Ki67、PHH3蛋白的表達檢測

取283例石蠟包埋的腫瘤組織標本，采用手工方法在組織芯片制作儀(韓國UNITMA公司)上制作組織芯片。首先在免疫組織化學切片上標記Ki67陽性點，然后在相對應的蠟塊上取樣，取樣直徑均2 mm，每個蠟塊取樣3個點，組織芯片間距1.5 mm。

采用免疫組織化學染色SP法在組織芯片上檢測Ki67、PHH3蛋白表達。濃縮型兔抗人PHH3單克隆抗體購自福州邁新公司，工作濃度1∶50；濃縮型兔抗人Ki67單克隆抗體購自上海杰浩生物公司，工作濃度1∶100；即用型HRP標記的羊抗兔/鼠二抗購自上海杰浩生物公司。以PBS代替一抗作為陰性對照，用已知的陽性對照切片作為陽性對照。

胞核呈暗褐色或棕黃色顆粒狀著色為陽性表達。在40倍高倍鏡下計數(shù)10個視野(10HPF)的PHH3陽性細胞數(shù)，取總數(shù)；在低倍鏡下取陽性率最高的區(qū)域，計數(shù)500～2 000個腫瘤細胞中Ki67陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞百分比。PHH3、Ki67免疫組織芯片均由兩位病理醫(yī)師獨立計數(shù)診斷。

四、隨訪

通過電話及門診問詢方式進行隨訪，隨訪截止時間為2016年5月31日。總生存期(overall survival,OS)定義為腫瘤確診后至患者死亡或至隨訪截止仍存活的時間。無瘤生存期(disease-free survival,DFS)定義為腫瘤確診后至腫瘤復發(fā)或至隨訪截止仍未復發(fā)的時間。

五、統(tǒng)計學處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。連續(xù)型變量若滿足正態(tài)分布和方差齊性，則采用t檢驗，否則采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗；分類變量比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank檢驗；兩變量之間的相關性采用Spearmen等級相關分析。繪制PHH3受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線，計算曲線下面積(area under curve, AUC)，確定對PNENs分級的臨界值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、臨床資料

本研究共納入PNENs患者283例，其中男性132例，女性151例，年齡16～78歲，平均(50±1)歲；功能性PNENs 44例，無功能性PNENs 239例；腫瘤直徑1.1～17 cm，平均(4.1±1.2)cm。

二、Ki67法的PNENs分級

每張組織芯片的免疫組織化學染色切片觀察Ki67平均耗時45 min。參考共識標準對PNENs進行分級，≤2%為G1級，3%～20%為G2級，21%～60%為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌瘤(PNET)G3級，>60%為胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌(PNEC) G3級。本組G1級(圖1A)127例，G2級(圖1B)116例，PNET G3級33例，PNEC G3級7例。

圖1 Ki67分級的PNENs G1級(1A)和G2級(1B)(SP ×400)

三、PHH3法PNENs分級標準的確定

每張組織芯片的免疫組織化學染色切片觀察PHH3平均耗時9 min。PHH3的ROC曲線見圖2。依據(jù)約登指數(shù)(G1與G2最大值0.992、G2與PNET G3最大值0.982、PNET G3與PNEC G3最大值1)和AUC面積(G1與G2為0.991，G2與PNET G3為0.999，PNET G3與PNEC G3為1.000)，分別選取10HPF下5、29和70個核分裂象作為G1和G2期，G2和PNET G3期，PNET G3和PNEC G3期的臨界值。按此PHH3標準，本組G1級(圖2A)118例，G2級(圖2B)119例，PNET G3級38例，PNEC G3級8例。PHH3法PNENs分級與Ki67法的分級呈正相關關系(r=0.941，P<0.001)。

圖2 PHH3的ROC曲線，G1與G2(2A)、G2與PNET G3(2B)、PNET G3與PNEC G3(2C)

圖3 PHH3分級的PNENs G1級(3A)和G2級(3B)(SP ×400)

四、PNENs組織PHH3、Ki67表達與臨床病理特征之間的關系

PNENs組織PHH3、Ki67表達與患者的年齡、性別及腫瘤有無功能、腫瘤部位均無相關性(P值均>0.05)，而與腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉移及TNM分期均呈正相關(P值均<0.05，表1)。

五、生存期分析

283例PNENs患者中34例(12%)失訪，249例(88%)獲得隨訪，隨訪時間為4～166個月，中位時間為42個月。PHH3、Ki67分級患者的術后OS及術后DFS曲線見圖4、5。PHH3、Ki67的PNENs分級均能夠很好地預測患者的預后。

討 論

PNENs的發(fā)病率逐年升高，從1973至1977年的0.17/10萬上升到2003至2007年的0.43/10萬，其原因可能與對PNENs認識的提高以及內(nèi)鏡和影像檢查技術的發(fā)展有關[6-7]。細胞增殖活性與PNENs的惡性程度密切相關，根據(jù)腫瘤細胞增殖活性來劃分PNENs惡性程度已被國內(nèi)外廣泛接受，但是根據(jù)腫瘤增殖指數(shù)Ki67和核分裂象對PNENs分級有明顯的缺點：(1)計算復雜。核分裂象計數(shù)單位為2 mm2，相當于20 mm目鏡的10個高倍鏡視野；若采用其他孔徑的目鏡，則需進行相應換算[8]，步驟繁復。(2)可重復性差。早期的核分裂象很難識別且易與凋亡小體、壞死細胞及核碎片相混淆[9-10]，因此醫(yī)師主觀因素對結果的影響較大。(3)計數(shù)耗時長。需在鏡下500～2 000個細胞中數(shù)出其中Ki67陽性的細胞數(shù)，并且要排除淋巴細胞和其他非腫瘤細胞，無論是手動還是自動計數(shù)，每個病例至少需要耗時15 min。(4)特異性不高。Ki67不僅能從M期的細胞檢出，也能從S、G1、G2期的細胞中檢出[11]，因此其不能真正反應細胞的增殖指數(shù)。

表1 PHH3和Ki67在PNENs患者中的表達及其與臨床病理參數(shù)的關系

圖4 PHH3分級的PNENs患者OS(4A)和DFS(4B)曲線 圖5 Ki67分級的PNENs患者OS(5A)和DFS(5B)曲線

1997年Hendzel等[12]首先提出PHH3作為核分裂的標志物，此后關于PHH3的研究不斷增加。PHH3是新近發(fā)現(xiàn)的5個核心組蛋白之一，在真核細胞中與其他組蛋白共同構成染色質中主要的蛋白組分[13]。

本研究建立了PHH3法PNENs的分級標準，結果顯示PHH3法與Ki67法的分級呈正相關。兩種分級方法均顯示與患者的年齡、性別及腫瘤有無功能、腫瘤部位無相關性，而與腫瘤直徑、組織學分級、淋巴結轉移、TNM分期呈正相關。兩種分級在G1、G2、PNET G3、PNEC G3級患者之間的預后差異均具有統(tǒng)計學意義。

采用PHH3法分級的優(yōu)勢：(1)高分辨率和準確率。特異性染色M期細胞的PHH3能夠消除在HE染色下含糊不清的核分裂計數(shù)，明顯區(qū)分核分裂象和凋亡小體，不同觀察者之間的差異性不大[14]。(2)高效省時。在低倍鏡下可很快找到PHH3 標記的核分裂熱點區(qū)域，大大縮短計數(shù)核分裂的時間，平均每例只需耗時3 min。(3)判斷生物學行為。 PHH3特異性染色核分裂象能更加準確地預示腫瘤生物學行為，現(xiàn)已經(jīng)用于評估腦膜瘤、星形細胞瘤、黑色素瘤、肺類癌以及子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤細胞的增殖活性[14-19]。因此，檢測PNENs組織中PHH3的表達對其病理診斷分級、臨床治療以及預后判斷具有重要臨床應用價值，但這一結果有待于更多研究中心的驗證。

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(本文編輯：冀凱宏)

Expression and significance of PHH3 in pancreatic neuroendocrine neoplasms

HanHuan,JiangHui,ZhengJiangming.

DepartmentofPathology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ZhengJiangming,Email:Jmzheng1962@163.com

Objective To investigate the expression of phospho-histone H3(PHH3) protein in pancreatic neuroendocrine neoplasms (PNENs) and explore its potential value for pathological grading of PNENs. Methods Clinical and pathological data of 283 patients with PNENs treated in Changhai Hospital from December 2000 to May 2016 were retrospectively analyzed. PNENs tissue chip was prepared, and immunohistochemistry was used to examine the expression of PHH3 and Ki67. The receiver operating characteristic curve for PHH3 was drawn and the area under the curve(AUC) was calculated to determine the cutoff value for PNENs grading. Ki67 was used for PNENs grading according to domestic and international criteria for PNENs classification. The relationship of PHH3 and Ki67 classification with clinical pathological features and prognosis of PNENs as well as the correlation between the two classification methods were analyzed. Results Of 283 patients, 132 were male and 151 were female, aged from 16 to 78 years old. The average age was (50±1) years old. There were 44 cases with functional PNENs and 239 with non-functional PNENs. The diameter of tumors ranged from 1.1 cm to 17 cm and the average diameter was (4.1±1.2)cm. According to the Ki67 standard, there were 127, 116, 33 and 7 cases of Grade G1, G2, pancreatic neuroendocrine tumor(PNET) G3 and pancreatic neuroendocrine cancer(PNEC) G3. According to the PHH3 positive correlation between the two grading criteria (r=0.941,P<0.001). PHH3 expression and PNENs grading were not correlated with age, gender, tumor functional or not and tumor locations (allP>0.05), but were both positively correlated with tumor size, histological grade, lymph node metastasis, TNM stage and prognosis (allP<0.05). The average time of observing PHH3 and Ki67 staining per case in the immunohistochemistry of tissue chip was 9 min and 45 min, respectively. Conclusions Detection of PHH3 expression in PNENs can be used for the pathological diagnosis, grading and prognostic evaluation, which was more accurate and convenient than Ki67 criteria.

Pancreatic neoplasms； Neuroendocrine tumors; Phospho-histone H3； Immunohistochemistry

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2017.01.005

200433 上海，第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院病理科

鄭建明，Email: Jmzheng1962@163.com

2016-11-14)