基于東亞金發蘚監測土壤鎘污染的生物學機理*

董 萌趙運林蔣道松周小梅李必才庫文珍

（1 湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南益陽 413000）

（2 中南林業科技大學環境科學與工程學院，長沙 410018）

基于東亞金發蘚監測土壤鎘污染的生物學機理*

董 萌1趙運林2蔣道松1周小梅1李必才1庫文珍1

（1 湖南城市學院化學與環境工程學院，湖南益陽 413000）

（2 中南林業科技大學環境科學與工程學院，長沙 410018）

采用對鎘具有高敏感性特征的苔蘚植物——東亞金發蘚（Pogonatum inflexum）為材料，以不同濃度梯度鎘污染基質作為脅迫條件，觀測該植物在鎘脅迫下的生長發育狀況、鎘富集能力、葉綠素含量、可溶性蛋白含量及MDA含量，并分析比較了各項指標變化特征與土壤中全鎘含量及有效鎘含量的相關性。結果顯示，供試土壤中有效鎘含量約占全鎘含量的20%～40%，東亞金發蘚對鎘的富集能力總體較弱，其最大富集濃度值為1.627 mg kg-1，最高富集系數為63.9%，植株富集濃度與土壤有效鎘含量之間的相關性高于全鎘；東亞金發蘚對鎘污染表現出顯著反應特征，植株孢子體和配子體受害癥狀明顯，1～2 mg kg-1以上的鎘脅迫（土壤有效鎘含量大于0.559 mg kg-1時）即可使葉部黃化、褐變，5 mg kg-1的鎘處理導致蒴柄彎折、植株枯亡；東亞金發蘚葉綠素含量、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量等生理指標變化特征受鎘脅迫影響明顯，且與有效鎘含量呈顯著相關性，適合作為東亞金發蘚監測土壤鎘污染及鎘生物有效性的指示指標。

東亞金發蘚；生物監測；土壤鎘污染；鎘生物有效性

鎘（Cd）是一種對生物體具有強毒性的重金屬元素，在土壤中較穩定、易于積累和難以消除。當前，土壤鎘污染已成為困擾許多國家糧食安全和人類健康的世界性環境問題，受到越來越廣泛的關注［1］。如何客觀、準確地評價土壤鎘污染及其生物有效性，已成為實際操作中需要解決的關鍵問題。近年來，苔蘚植物監測法在大氣鎘污染監測中得到廣泛應用［2-4］，該類植物由于結構簡單、細胞分化程度低，植株體表面無角質層、蠟質層覆蓋，對環境污染物敏感性強，鎘等重金屬離子或顆粒可直接通過表層薄壁細胞吸收或吸附進入，導致植株迅速表現出受害癥狀，因此適于進行環境污染監測。例如：廣泛分布于地中海區域的柏狀灰蘚和側生蘚不僅能有效監測當地大氣Cd、Cr、Hg等污染狀況，而且可通過植物體中氮同位素標記來識別定位氮排放源［5］；歐洲學者［6-8］研究和比較了灰蘚、泥炭蘚、大絹蘚、青蘚對城市郊區大氣中鎘等重金屬的吸附特征，以此作為監測效果的重要依據，并發現了大絹蘚莖葉的不同老化程度對監測鎘污染有較大影響；利用裝有泥炭蘚的苔蘚袋法在芬蘭等國家目前已作為標準化監測手段。同樣，利用某種對土壤鎘離子具有較低耐受性的植物，通過其生長狀況和生理反應來指示土壤鎘污染及修復效果，可具有較強的直觀性和說服力；充當這一檢驗標準的植物體，個體大小應適宜，組織進化程度盡可能簡單，易受到環境毒害并表現出癥狀。本研究以前期篩選到的一種對鎘具有強敏感性的孢子植物——東亞金發蘚（Pogonatum inflexum）為材料，將其植入不同濃度梯度鎘污染的土壤中，通過觀測其生長反應特征、生理指標變化及其與土壤有效態鎘含量的“劑量—效應”關系，初步探索鎘的生物有效性對植物生長的影響，從而為進一步研究土壤鎘污染的生物監測機理提供理論依據和技術參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物源材料——東亞金發蘚植株及土壤基質均采自南洞庭湖濕地的東南洲附近（28°52′34.14″ N，112° 23′ 39.36″ E），采集方式為小塊區域水平鏟集法（東亞金發蘚基部叢集群生），植株根部帶土厚度約2 cm；源材料帶回實驗室后放置于水箱中的網狀支架上，根部浸沒于水中并輕微搖動數小時，盡量保障根部結構不受損傷，去除根部泥土后移植于經過處理的淺盤土壤基質中。土壤基本理化性質見表1。

1.2 試驗方法

分別稱取2.0 kg風干土壤基質，平鋪于直徑35 cm、高6 cm的聚乙烯淺盤內；溶解一定量的Cd（NO3）2·4H2O（分析純）施入，充分混勻，使淺盤內土壤基質干重時的Cd添加濃度分別為1.0 mg kg-1、2.0 mg kg-1、3.0 mg kg-1、4.0 mg kg-1、5.0 mg kg-1，以零添加的原土作為對照；每個處理濃度設置5盤作為重復，自然陳化平衡14 d后用于植株移植。東亞金發蘚植株移栽至淺盤后，放置于接近自然環境的網室培養架上，視每天的光照、溫度、濕度等環境條件，定時噴灑300～500 ml自來水于每盤中。自移植后的第二天開始觀察、記錄東亞金發蘚植株的形態學特征及外觀生長反應，包括植株整體長勢、葉數量及發育狀況、配子體與孢子體受害表征、黃化及致死情況等，直至研究過程結束。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Basic physic-chemical properties of the tested soil

1.3 樣品采集與分析

在試驗第7天剪取東亞金發蘚植株莖葉部，用于鎘濃度及葉綠素含量等參數的測定（東亞金發蘚葉片由單層細胞構成，葉面輕薄且貼莖生長，生物量小，不易單獨剪取；莖細胞構造均一且無真正維管束，主要起支撐和光合作用）：準確稱取經烘干、粉碎后的植物樣品0.1 g，加入體積比為4∶1的HNO3-HClO4混合液10 ml，WX-4000型微波密閉消解系統進行消解（190 ℃、25 atm、 2 min），島津AA-6300型石墨爐原子吸收分光光度計測定樣品中的Cd含量［9］；采用乙醇-丙酮混合液研磨、提取、過濾后，分光光度計法測定鮮樣品中的葉綠素含量［10］；按照“0.1 mmol L-1的磷酸緩沖液（pH為7.8，含1%的聚乙烯吡咯烷酮）研磨、8 000 r min-1離心”的方式制得鮮樣品粗提取液后，采用考馬斯亮藍G250比色法測定可溶性蛋白含量，硫代巴比妥酸比色法（TBA法）測定丙二醛含量。可溶性蛋白與丙二醛的測定過程按照試劑盒說明書進行，測定結果依據說明書中所列公式計算，所用試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

在每一濃度梯度鎘處理的土壤樣品中，用打孔混合法取少量基質用于全鎘及有效鎘含量的分析：準確稱取粉碎后土壤干樣品0.2 g，加入體積比為3∶1∶1的HCl-HNO3-HF混合液10 ml，WX-4000型微波密閉消解系統進行消解后（220 ℃、35 atm、5 min），島津AA-6300型石墨爐原子吸收分光光度計測定樣品中的Cd含量；參照改良后的Tessier提取法［11］及BCR提取法［12］，樣品中加入20 ml濃度為0.1 mol L-1的CH3COOH（有效鎘萃取劑），充分混勻后，室溫振蕩12 h，10 000 r min-1離心40 min，重復該過程2次，收集全部上清液進行蒸發后消解，島津AA-6300型石墨爐原子吸收分光光度計測定樣品Cd含量。

樣品檢測過程中，重金屬含量分析所用的標準貯備液（C=1 000 mg L-1）購買于國家環境保護部標準樣品研究所，所用的標準參比物質型號為GBW07437（土壤）和GBW（E）090066（植物）；原子吸收儀自帶GFA-EX7i石墨爐電流發生器和ASC-6100自動進樣器，測定次數為3，最大測定次數為5，測定結果相對標準偏差（RSD）設定為3%；所配制標準溶液濃度范圍為：0.5、1、2、4、8（ng ml-1），標準曲線線性關系系數保證在99.7%以上；樣品加標回收試驗的回收率范圍為98.1%～102.6%。

1.4 數據處理與統計分析

所測得原始數據用Excel 2010和SPSS 13.0軟件進行統計分析，處理后數據以“平均值±標準差”的形式給出。

2 結 果

2.1 東亞金發蘚對土壤鎘脅迫的外觀生長反應

暴露在空氣、水體等環境中的敏感性植物體，在生長過程中受到污染物質的毒害而表現出一系列外觀反應癥狀，是利用苔蘚植物進行環境污染監測的基礎和依據［13］。本研究觀測結果顯示，東亞金發蘚在根部所處鎘環境下表現出顯著反應特征：對照處理（未施加鎘污染）的植株體生長正常、色澤通綠，無明顯癥狀表現（圖1a）；1.0～2.0 mg kg-1鎘處理的植株，其下方葉片最先出現黃化現象，該濃度處理下植株的孢子體尚無明顯癥狀反應，隨著鎘處理濃度增加和時間延長，植株葉片受害程度愈加明顯（圖1b）；3.0～4.0 mg kg-1鎘處理下，植株葉片受害程度進一步加溶，孢子體受害癥狀顯著，孢蒴及蒴柄發生褐變、彎曲，較多的孢子體呈現枯黃萎蔫現象（圖1c）；4.0～5.0 mg kg-1鎘處理的大部分植株葉片呈現枯萎卷曲，孢子體垂落，整株呈枯亡狀態（圖1d）。但整個過程中植株高度變化不明顯，葉片數量也未見增多，其原因一方面在于苔蘚植物本身生長緩慢，本觀測過程持續時間較短，因此未表現出株高及葉片數量的差異；另一方面本實驗所用植株處于有性生殖期的孢子體世代，該時期植株生長發育過程基本完成，故長勢方面不易受環境脅迫影響。整體而言，東亞金發蘚外觀性狀對鎘脅迫表現出了明顯的反應特征。國內外相關研究結果［13-14］表明，利用苔蘚或其他一些進化程度較低的植物（如附生植物鐵蘭）進行大氣污染監測時，植物體外觀形態學變化可作為重要監測依據，歸因于此類植物的組織進化和器官分化程度低，受到外界污染毒害時能快速、直觀地表現出癥狀。綜合本研究材料的表現結果來看，東亞金發蘚為較理想的土壤鎘污染監測植物。

2.2 東亞金發蘚植株Cd含量富集特征

東亞金發蘚土壤基質中的全鎘含量、有效鎘含量以及植株Cd含量見表2。本研究所采用土壤基質自身含有一定量的鎘，故所測得全鎘含量略高于人工施加鎘濃度值；梯度濃度鎘處理條件下，所測得有效鎘含量約占全鎘含量的20%～40%，且隨處理濃度增加，有效鎘所占比例呈下降趨勢；東亞金發蘚植株Cd含量隨處理梯度升高而增加，但整體值較低，為0.115～1.627 mg kg-1，富集系數（即植株鎘含量與土壤全鎘含量之比）介于29.9%～63.9%，隨鎘處理濃度升高而下降。

分別對土壤基質全鎘含量、有效鎘含量與植株Cd含量進行了相關性分析（圖2），結果顯示，東亞金發蘚植株Cd含量與基質全鎘含量及有效鎘含量均呈正相關，且與有效鎘含量的相關性高于全鎘（據復相關性系數R2大小判定）。由此可見，東亞金發蘚對土壤中鎘的富集效率與鎘生物有效性密切相關，即植株Cd含量主要受土壤有效鎘含量影響。

2.3 鎘生物有效性對植株生理狀況的影響

不同鎘處理濃度下，東亞金發蘚植株體內葉綠素、可溶性蛋白及丙二醛（MDA）三種生理活性物質的含量變化見圖3。可以看出，不同程度的鎘脅迫對植株上述生理指標均產生明顯影響，尤其是2.0 mg kg-1以上的鎘濃度顯著降低了植株葉綠素和可溶性蛋白的含量（最大下降幅度分別為87.2%和53.2%），并較大程度地增加了膜脂過氧化產物丙二醛的含量（最大增加幅度為61.7%）。5.0 mg kg-1鎘處理下的植株已呈枯亡狀態，該濃度下葉綠素和可溶性蛋白含量呈現最低值；MDA含量最大值的出現通常預示著活體植株處于逆境脅迫最嚴重的狀態［15-16］，本試驗中當鎘處理濃度為4.0 mg kg-1時MDA含量達到最高值，此后因植株枯亡而有所下降。結合前述鎘脅迫下植株的外觀生長反應可知，東亞金發蘚對土壤鎘污染的耐受限值遠較一般的植物種類小［17-19］，3.0～5.0 mg kg-1的土壤全鎘濃度已使植株的生長生理受到嚴重傷害。由此可見，東亞金發蘚對鎘的高敏感性特征適于進行土壤鎘污染監測。

圖1 對照處理（a）與鎘污染處理（b-d）下的植株生長狀況Fig. 1 Growth status of plants under control treatment（a）and under Cd stress（b-d）

表2 不同處理土壤基質Cd含量與植株Cd含量Table 2 Cd contents in tested soil and plant samples relative to treatment

圖2 植株Cd含量與土壤全鎘（a）及有效鎘（b）的相關關系Fig. 2 Correlation between Cd content in plant with total（a）and available（b）Cd content in soil

圖3 不同濃度Cd處理植株葉綠素（a）、可溶性蛋白（b）及丙二醛（c）含量Fig. 3 Contents of chlorophyll（a），soluble protein（b）and MDA（c）in plants grown under Cd stress relative to Cd concentration

對東亞金發蘚生理狀況與鎘生物有效性之間的關系作了相關性分析（圖4），結果顯示，鎘脅迫能較大程度地影響植株葉綠素與可溶性蛋白含量，二者均與土壤全鎘及有效鎘之間呈顯著負相關，且與有效鎘之間的相關性更強（復相關性系數R2分別為0.973 2和0.967 2）；MDA的增加與植株所受鎘脅迫程度呈正相關，且與有效鎘的相關性更強（R2=0.739 2﹥0.431 9）。相對于土壤全鎘，土壤有效鎘是影響植物生長過程和生理狀況的主要因素。

圖4 植株葉綠素、可溶性蛋白、丙二醛含量與土壤全鎘（a，c，e）及有效鎘（b，d，f）的相關關系Fig. 4 Correlation between contents of chlorophyll，soluble protein and MDA in plant with total（a，c，e）and available（b，d，f）Cd content in soils

3 討 論

3.1 生物監測法在環境鎘污染監測中的應用

如何對土壤鎘污染及其生物有效性進行科學、有效的評價，是當前土壤鎘污染修復領域面臨的一個現實問題。尤其是經修復治理后的土壤鎘含量是否達到安全濃度標準，最終應以生存于其中的動植物生長發育狀況予以評判。該方面研究多見于動物毒理學實驗，例如通過觀測蝸牛、蚯蚓、彈尾目昆蟲以及陸生等足類軟體動物的生理和行為特征，可有效檢驗重金屬污染土壤的修復效果［20-21］；對鯰魚的生長狀況及各部分器官中重金屬的蓄積情況進行分析，能間接反映出浮萍、滿江紅等水生植物對尾礦污水及底泥的處理質量［22］。對于苔蘚植物而言，由于其自身具有結構簡單、組織分化程度低等特征，對環境中污染物質的敏感性較強，近年來廣泛用于環境污染監測研究。例如苔蘚、地衣、菌類，以及一些附生植物（如鐵蘭等），此類植物表面無角質層、蠟質層覆蓋，污染物可直接通過表層薄壁細胞吸附進入，故它們對大氣中的重金屬粉塵顆粒、汞蒸汽等物質極為敏感，一直作為大氣污染監測的理想植物［3，8，23-26］。此外，苔蘚植物監測法還具有對環境擾動性小、操作簡單、耗費低、監測周期短、可實現原位動態實時監測等優點，進一步提高了其應用價值［8］。但這些植物能否用于監測土壤中的重金屬，目前為止少有人研究。理論上，這些植物的假根對表層土壤也具有較強的感應能力，土壤重金屬離子可迅速通過假根薄壁細胞而對植物體造成傷害，與利用其地上部分監測大氣污染在原理上具有相似性，該方面值得進行探索試驗。

本研究所選用的東亞金發蘚具備適于監測土壤鎘污染的一系列特征：對土壤中的鎘具有強敏感性，易受到鎘離子毒害并在短時間內表現出癥狀；植株大小適宜，其孢子體世代的成熟植株高度可達10 cm，易于進行生長指標觀測；植株結構較簡單，無真正的維管束分化，孢子體寄生于配子體上，各器官的細胞構造均一且多為單細胞層，這些特征均適于進行顯微觀察。國內外研究資料中，頂生蘚屬和側生蘚屬［7］對Cd等重金屬的低吸收值和高靈敏度特征為其監測大氣重金屬污染提供了應用依據；鱗葉蘚和尖葉美喙蘚［27］的膜脂過氧化程度、抗氧化酶防御系統活性受Cd影響明顯，且葉綠素熒光值、花青素含量等在Cd脅迫下亦有顯著變化，據此可辨別Cd、Hg等重金屬的污染類別及毒性大小。結合本研究結果認為，東亞金發蘚植株耐Cd含量低，易受到鎘離子傷害，植株外觀形態、葉綠素含量、可溶性蛋白含量及MDA含量等生理參數均對鎘毒較敏感，且各項指標的反應程度較好地對應了土壤中的鎘含量變化，因此這些指標參數適合用于指示東亞金發蘚監測土壤鎘污染。

3.2 環境鎘污染及其生物有效性的評價方法

重金屬長期存在于土壤中，各種化學形態之間不斷發生相互轉化，并伴隨著吸附-解吸、溶解-沉淀、氧化-還原、甲基化-去甲基化等多種動態理化過程，其生物有效性、毒性大小和生態風險程度也處于不斷變化中［28］。較多的研究［29-31］認為，土壤全鎘含量雖可作為衡量其污染程度和生態風險的依據，但鎘生物有效性則是更科學的評價參數。原因在于，土壤中真正對生物生長造成影響的鎘，取決于能被生物體吸收利用的那部分有效態含量。

對鎘生物有效性的評價，多見于利用有機酸、螯合劑等化學淋洗劑提取有效態的方式進行［28-30］。相對于此類化學檢測法，生物測試法則可借助生物體自身特征來反映鎘生物有效性，如歐洲赤松在修復土壤鎘污染時，其松針中的鎘含量能較好地指示土壤中鎘的生物可利用性，同時也能反映出土壤理化性質［32］；利用玉米植株處理含鎘廢液后，可根據其葉片中葉綠素熒光值變化及廢液對青藻菌光合效應的抑制程度來評測廢水中鎘的生物有效性［33］；也有研究表明，化學測定法與生物測試法評價土壤重金屬生物有效性時，二者在結果上具有統一性，但相比而言后者靈敏度更高，甚至可用以區別添加不同改良劑后的效果［20，31］。綜合而言，建議優先考慮生物監測手段，或將兩種方法相結合，互為補充，共同評價土壤重金屬的生物有效性。本研究中，以提取的有效態鎘含量作為土壤鎘生物有效性的指示參數，并探析其與東亞金發蘚生長發育狀況、植株Cd含量、葉綠素含量、可溶性蛋白含量、MDA含量等指標之間的量效關系，結果表明鎘生物有效性與上述指標變化密切相關，進一步證實了鎘生物有效性在很大程度上影響植物生長和生理，因此可作為綜合反映土壤鎘污染及生態安全性的重要依據。

4 結 論

東亞金發蘚植株對土壤中鎘的富集水平低、耐受性弱、敏感度高，易感應鎘污染并在短時間內表現出癥狀，可作為有效監測土壤鎘污染的植物材料；植株外觀形態、葉綠素含量、可溶性蛋白含量及MDA含量能直接反映土壤的鎘脅迫程度，可作為東亞金發蘚監測土壤鎘污染的指示指標；植株Cd含量、生長發育狀況及生理指標變化均與土壤中有效鎘含量呈顯著相關關系，且相關性大于土壤中全鎘含量。因此，鎘生物有效性在很大程度上影響植物生長，并可用于反映土壤鎘污染及生態安全性。

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Biological Mechanisms of Using Pogonatum Inf exum to Monitor Soil Cd Pollution

DONG Meng1ZHAO Yunlin2JIANG Daosong1ZHOU Xiaomei1LI Bicai1KU Wenzhen1
（1 College of Chemistry and Environment Engineering，Hunan City University，Yiyang，Hunan 413000，China）
（2 College of Environmental Science and Engineering，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410018，China）

【Objective】How to monitor and assess soil Cd pollution and bioavailability is currently an issue of great concern. However，measurements of soil available Cd contents using the conventional chemical methods may only serve as certain reference，because they are not good enough to intuitively and truly reflect the damages soil Cd2+does to plants. Bryophyta are simple in structure，free of any cuticle on their surface and quite sensitive to pollutants，so they are usually used in monitoring environmental pollution. In this paper，an effective method was preliminarily studied to monitor and evaluate soil Cd pollution and Cd bioavailability using Pogonatum inflexum，a species of bryophyte highly sensitive to soil Cd. A mature plant of the sporophytic generation of Pogonatum inflexum could be as high as 10 cm. Besides，it is simple in surface structure with no vascular bundle differentiation，but with sporophytes parasitizing on gametophytes. Furthermore，the various organs of Pogonatum inflexum are homogeneous in cell structure and mostly monolayer cells.【Method】In the experiment to validate effectiveness of the method，the tested soil was prepared into media，different in Cd contamination degree（1～5 mg kg-1），for culture of Pogonatum inflexum. Growth，Cd enrichment，chlorophyll content，soluble protein content and MDA concentration of the bryophyte was observed and/or determined. Soil available Cd contents extracted with acetic acid were cited as indicator parameter for soil Cd bioavailability，and then analysis was done of correlations of the above described indices with content of soil total Cd and content of soil available Cd，separately.【Result】Results show that in the test soil，bioavailable Cd accounted for about 20%～40% of total Cd. All the indexes of Pogonatum inflexum mentioned above were closely related to soil Cd stress，especially when soil Cd concentration was higher than 3 mg kg-1. Pogonatum inflexum was low in Cd enrichment and in tolerance to Cd as well. It could enrich as high as Cd 1.627 mg kg-1，with enrichment coefficient being 63.9% and Cd concentration in Pogonatum inflexum was more closely related to soil bioavailable Cd than to soil total Cd. Pogonatum inflexum responded quite apparently to soil Cd pollution，with visible symptoms such as damaged sporophytes and gametophytes. When soil Cd concentration was higher than 1～2 mg kg-1（available Cd concentration was higher than 0.559 mg kg-1），leaves of Pogonatum inflexum turned yellow and brown；when soil Cd concentration got up to 5 mg kg-1，seta softened and kinked，till the plants withered dead. Changes in physiological and biochemical indexes of the tested plants，such as contents of chlorophyll，soluble protein and MDA，were apparently related to soil Cd stress，especially to soil bioavailable Cd contents，and corresponded well to changes in soil Cd pollution level.【Conclusion】Therefore，the contents of chlorophyll，soluble protein and MDA in Pogonatum inflexum can be used as indicators to monitor and evaluate soil Cd pollution and bioavailabilty. Pogonatum inflexum is an ideal material to be used to effectively monitor soil Cd pollution thanks to its high sensitivity to soil Cd2+and its readiness and intuitiveness in displaying damage symptoms.

Pogonatum inflexum；Biomonitoring；Cd-contaminated soil；Bioavailability of Cd

X171.5

A

10.11766/trxb201604180090

（責任編輯：盧 萍）

* 湖南省自然科學基金項目（2016JJ4015，2015JJ4012）和湖南省科技計劃重點項目（2010SK2004）資助 Supported by the Natural Science Foundation of Hunan Province（Nos. 2016JJ4015，2015JJ4012）and the Key Projects of Science and Technology Plan of Hunan Province（No. 2010SK2004）

董 萌（1982—），男，山東濟寧人，博士，副教授，主要從事土壤重金屬污染與修復研究。E-mail：dongmeng1001@163.com

2016-04-18；

2016-07-18；優先數字出版日期（www.cnki.net）：2016-11-08