基因沉默治療惡性腫瘤的研究進展

王正想(綜述)，劉思源(審校)

(1.河北省滄州市中心醫院皮膚科，河北 滄州 061001；2.河北醫科大學第三醫院骨與軟組織腫瘤科，河北 石家莊 050051)

·綜 述·

基因沉默治療惡性腫瘤的研究進展

王正想1(綜述)，劉思源2*(審校)

(1.河北省滄州市中心醫院皮膚科，河北 滄州 061001；2.河北醫科大學第三醫院骨與軟組織腫瘤科，河北 石家莊 050051)

基因沉默；腫瘤，繼發原發性；綜述文獻

早在1985年,吳曼院士就提出了惡性腫瘤是基因治療的重要目標，隨著醫學的不斷進步，人們逐漸發現所有的惡性腫瘤都是基因病，都存在一個或幾個不同基因的異常表達，所以從基因水平治療惡性腫瘤一直是醫學界不斷追求的方向，而且近年來也取得了巨大的進展，如直腸癌可以用HLA-B7治療，肺癌可以用p16基因治療，神經膠質細胞瘤可用自殺基因治療，轉移性乳腺癌可以用IL-2治療等，部分腫瘤基因治療的臨床試驗已取得了一定效果。但針對單個基因的治療一般不能取得好的效果, 因為所有腫瘤都屬于多基因疾病。RNA干擾(RNA interference RNAi)技術恰恰可以彌補單基因治療的不足，該方法能抑制多個基因的表達，能夠針對信號通路的多個基因或者基因族的共同序列同時進行抑制，從而更有效地控制腫瘤生長。RNAi產生的基因沉默是由一種雙鏈RNA(double-standed RNA,dsRNA)所誘發的。在此過程中，因為降解了與dsRNA有同源序列的信使RNA(mRNA)，因此該基因的表達受到了抑制。因RNAi所致的基因沉默發生在轉錄后，所以被稱為轉錄后基因沉默(post transeriptional gene silencing，PTGS)。RNAi是一項新興基因表達阻斷技術，其優點是可以簡單、快速地封閉目的基因，制備特定基因缺失的表型，以研究基因功能[1-3]。

1 基因沉默的發現

1995年，美國康奈爾大學的Guo等[4]在利用RNA反義技術研究秀麗線蟲(C.elegans)的par-1基因功能時發現，將與目的基因mRNA互補的反義RNA導入線蟲細胞，引起目的基因沉默。后將與mRNA序列相同的正義RNA導入細胞，出現相同的結果。1998年線蟲基因組計劃完成之后，馬薩諸塞大學醫學院的Mello和卡耐基研究院的Fire[5]發現Guo遇到的正義RNA抑制基因表達的現象，以及過去的反義RNA技術對基因表達的阻斷，是由于體外轉錄得到的RNA中污染了微量的dsDNA造成的,首次在秀麗線蟲中證明上述現象屬于轉錄后水平的基因沉默。他們首先將體外轉錄得到的單鏈RNA(single-standed RNA,ssRNA)純化，然后注射到線蟲體內，發現基因抑制效應變的微弱。與之相反的是，經過純化的dsRNA能夠高效特異性阻斷相應基因的表達，且抑制基因表達的效率較純化前的反義RNA至少提高了2個數量級。該小組將這一現象稱為RNA干涉，從此誕生了新的基因功能研究領域。

2 基因沉默的機制

RNAi引起的轉錄后基因沉默分為起始階段和效應階段：起始階段是長鏈dsRNA被切割為21～23 bp長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNA,sRNA)的過程；效應階段是與siRNA互補的mRNA降解的過程。

2.1 起始階段 由外源導入或者由轉基因、病毒轉染等途徑引入的雙鏈RNA，被Dicer酶(Dicer酶是RNaseⅢ家族的成員，廣泛存在于各種生物體內。)降解為21～23bp的雙鏈sRNA，這些sRNA具有3羥基末端、5磷酸及有2 bp的3突出端，與所作用的靶mRNA序列具有同源性，從而在RNAi調控途徑中起著關鍵的作用。

2.2 效應階段 在解旋酶的作用下, siRNA可解鏈成為正義鏈和反義鏈,其中的反義鏈可指導形成一種核蛋白體復合物,稱之為RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC是一種核糖蛋白,包含有蛋白成分和RNA,其中的RNA即是siRNA。核酸內切酶、外切酶、解旋酶及同源RNA鏈等組成其蛋白成分[6]。在線蟲體內,僅少量的dsRNA分子就可以引起大量mRNA的降解,并能向鄰近的區域進行擴展,這表明某個信號擴散傳遞的現象可能存在于該過程,這種現象被稱為傳遞RNAi。但傳遞RNAi現象的機制人們一直在研究。可能傳遞RNAi現象RNA是利用原來的siRNA作為引物重新合成dsRNA,此過程需要一個RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用,然后再通過Dicer作用成為次級siRNA,形成新的siRNA又進入上述的循環,進一步作用于靶向mRNA,這一過程也被稱為隨機降解性聚合酶鏈反應[7]。

3 基因沉默的優點

基因沉默技術具有特異性、高效性、靶點的多樣性與選擇性、效應的可遺傳性、放大效應等特點，因而在臨床中有廣闊的應用空間，有望給腫瘤的治療帶來革命性的進展。

4 基因沉默干擾在各種腫瘤中的應用

4.1 基因沉默干擾在鼻咽癌治療中的應用 皰疹病毒是導致鼻咽癌發生的重要因素，由EBV編碼的LMP-1(latent membrane protein-1)與癌癥的發生和轉移密切相關。有研究顯示以腺病毒相關病毒為載體，包裝合成表達針對LMP-1的siRNA，并對EBV陽性的人類鼻咽癌C666-1細胞系感染，感染前后觀察細胞存活率和跨膜侵襲能力，結果發現細胞存活率及跨膜侵襲能力在感染后明顯下降[8]。在體內實驗中，癌細胞轉移少，腫瘤轉移率降低，但腫瘤大小差異無統計學意義，不能表明抑制LMP-1后腫瘤生長受影響。RNAi可以抑制病毒癌基因的表達，能夠抑制鼻咽癌癌細胞的生長，甚至使鼻咽癌癌細胞凋亡，從而降低鼻咽癌的侵襲能力，降低鼻咽癌轉移的發生率。

4.2 基因沉默在肺癌治療中的應用 隨著工業化的飛速發展，環境污染也進一步加重，尤其是汽車尾氣的排放，使肺癌的發病率逐漸上升，目前手術仍然是治療肺癌的主要方法，研究肺癌的基因治療是醫學界的熱點問題。Ras蛋白[9]是一種由ras基因編碼的GTP結合蛋白，該蛋白具有GTP酶活性，是一種重要的信號轉導分子。人類肺癌的發生與K-ras V12突變基因的表達密切相關。有研究人員用針對K-ras V12表達的siRNA對肺癌細胞系H441進行感染，結果降低了K-ras的mRNA表達量，ras蛋白表達水平也降低，轉染后的細胞較對照組的細胞增殖速度降低，細胞凋亡的數目增高。在體內實驗中，裸鼠腫瘤的生長也可受到siRNA的影響而被抑制。

4.3 基因沉默在卵巢癌治療研究中的應用 卵巢的惡性腫瘤是女性生殖器三大惡性腫瘤之一。卵巢癌具有臨床發現晚、轉移早、治療效果差等特點，素有“沉默殺手”之稱，多數患者就診時已處于疾病的晚期階段，預后不良，卵巢惡性腫瘤的5年存活率僅15%左右。至今缺乏有效的早期診斷方法[10]。目前治療卵巢癌的主要手段是手術治療聯合化療，但其預后差，不良反應大。張國強等[11]利用基因重組技術，將PPO基因的cDNA裝入pcDNA/His載體，然后對NIH/3T3細胞株進行轉染，篩選出具有增殖活性并能穩定表達的單克隆細胞株，然后用PPO的RNA干擾此細胞株，結果發現PCNA的表達降低，p-MEK表達量減少。對卵巢癌細胞株OVK18和OVCAR-3進行RNAi后，注入裸鼠體內進行體內實驗結果證實，實驗組和對照組腫瘤的大小差異有統計學意義，表明卵巢癌細胞在活體上的生長受到抑制。目前RNAi對卵巢癌治療的研究尚處在基礎研究階段，各種基因對卵巢癌發生發展和轉移的影響，以及作用的具體途徑和機制，仍需進一步研究，從基礎研究階段過渡到臨床應用階段，更需各專業學者的不斷探索。

4.4 基因沉默在肝癌治療中的應用 我國肝炎的發病率遠高于其他國家。肝炎的發病率高，傳播性強，而大多數肝癌都是由肝炎、肝硬化進展而形成的，因此我國肝癌的患病率居高不下。目前治療肝癌的手段仍停留在外科手術和放療、化療階段。手術切除僅限于早期，放療和化療不良反應大，大量科研工作者正在為尋找有效治療肝癌的方法進行不斷的探索。研究顯示采用選擇性COX-2抑制劑NS-398作用于肝癌細胞，RT-PCR及Western blot檢測COX-2表達降低后，肝癌細胞增殖明顯受到抑制[12]。有研究表明利用陽離子脂質體將COX-2 siRNA轉染入肝癌細胞，MTT法觀察HepG2細胞系增殖特性的變化，結果顯示肝癌細胞增殖被明顯抑制，尤其以轉染后24 h最為顯著[13]。從人肝細胞癌細胞中NF-κB p65的cDNA序列中選擇3個位點作為RNAi的靶位點，以螢光素酶基因siRNA作為對照，分別轉染Hep3B和SMMC-7721細胞，轉染后48 h提取總RNA，用逆轉錄半定量PCR方法檢測各組RNA的表達，結果表明在2個細胞株中，3條siRNA都能夠抑制p65基因的表達，其中抑制作用最顯著的是第2和第3條siRNA[14]。

4.5 基因沉默在喉癌治療中的應用 有研究利用基因重組技術，構建蛋白激酶CKZα靶向siRNA表達質粒psiRNA-hHlneo-CKZ的脂質體，轉染法轉染Hep-2細胞，觀察其對人喉癌細胞系Hep-2的侵襲是否有抑制作用，結果顯示Hep-2細胞蛋白激酶CKZα的表達能被蛋白激酶CKZα靶向siRNA表達載體抑制， Hep-2細胞侵襲力降低[15]。實驗根據hTERTcDNA序列構建特異性表達hTERTmRNA，有熒光素基因的shRNA，真核表達質粒PshRNAi，隨機選取一段與人類基因無同源性的堿基序列，構建表達shRNA的含熒光素基因質粒PshRNAZ作為對照組。實驗分為實驗組(質粒PshRNAI)、對照組(PshRNAZ)、空白對照組(空白培養液)，各組分別轉染喉癌Hep-2細胞，觀察RNA干擾抑制端粒酶逆轉錄酶(human telome raserevese transcriptase，hTERT)能否影響喉癌Hep-2細胞凋亡、p53及caspase-3蛋白的表達。結果表明RNAi抑制hTERT基因表達后喉癌細胞增殖率降低，細胞凋亡增加，可能p53及caspase-3蛋白表達上調后誘導了細胞的凋亡[16]。目前放射治療也是喉癌的主要治療手段，但由于個體差異和腫瘤大小、生長部位、腫瘤分期不同，不同患者對放療的敏感性也不同。RNAi技術應用于喉癌中可以提高癌細胞對放療的敏感性[17]。

4.6 基因沉默在乳腺癌治療中的應用 Gu等[18]完成針對人VEGF-C基因的siRNA表達載體的構建后,轉染乳腺癌MDA-MB-43細胞，利用RNAi技術沉默VEGF-C基因。結果表明轉染后VEGF-C基因及蛋白水平表達量明顯減少,COX-2和Bcl-2的表達水平降低,細胞體外生長狀態不佳,細胞凋亡明顯增多，轉染72 h后凋亡率達到60%,乳腺癌MDA-MB-43細胞的凋亡率顯著高于對照組。在完成針對人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)基因[19]的RNAi表達載體后,利用RNAi技術沉默hTERT基因，轉染乳腺癌MCF-7細胞,結果顯示hTERT基因的表達降低，進而抑制乳腺癌MCF-7細胞體外生長狀態，細胞凋亡率明顯增加。有學者設計兩對針對C35編碼區的siRNA,并合成構建到轉錄載體pTZU6+1上,形成重組質粒siRNA-C35,通過脂質體介導轉染乳腺癌細胞株T47D,結果顯示質粒pTZU6+1、pshRNA-C35-1和pshRNA-C35-2組的相對表達率分別是脂質體對照組的95.3%、40.0%和28.4%[20]。siRNA轉錄載體轉染乳腺癌細胞株能有效抑制乳腺癌細胞中C35基因的表達。

4.7 基因沉默在骨肉瘤中的應用 骨肉瘤發病率高，惡性程度大，預后極差，手術聯合化療雖然在一定程度上提高了患者的5年生存率[21]，但化療不良反應大，且損傷人體各臟器，因此臨床上迫切需要尋找骨肉瘤治療的新方法。有研究報道，survivin基因與骨肉瘤細胞凋亡有密切關系，應用siRNA技術沉默survivin基因啟動子可明顯促進骨腫瘤細胞的凋亡[22]。Fossey 等[23]發現轉錄活化子3是骨腫瘤細胞凋亡過程中的重要細胞因子，應用siRNA技術沉默轉錄活化子3，結果發現可誘導骨腫瘤細胞的凋亡，細胞增殖和活力受到抑制。同時可以下調survivin、VEGF、MMP-2等相關基因的表達。有研究報道用siRNA技術進行基因沉默cyclin基因，進行骨肉瘤細胞體內外實驗，結果證實基因沉默對骨腫瘤細胞的生長有一定的抑制作用[24-25]。

4.8 基因沉默在皮膚惡性腫瘤中的應用 皮膚的惡性腫瘤主要包括三類：基底細胞癌(basalcell carcinoma,BCC)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous maligant melanoma,CMM)。隨著醫學的不斷進步，細胞生物學、分子生物學、免疫學、分子遺傳學迅猛發展，對皮膚癌的治療方法也不斷改進，由最早的單純手術和激光方法，逐漸發展到化學治療、生物治療、放射治療、光動力學療法、基因治療。而RNAi是基因治療的重要方法之一，這種技術的優點是可以特異性地下調致病基因，達到治療腫瘤的目的，與其他治療惡性腫瘤方法比較有顯著的優點。凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein, IAP)是一類重要的抗細胞凋亡因子。Livin基因是新近發現的一個IAP家族成員,有2種異構體分別是α和β,在體內作用機制復雜[26-29],在多種腫瘤組織都有特異的分布[30-34]。

采用RT-PCR方法檢測A375細胞等35種黑素瘤細胞株,發現 livin mRNA在各種黑素瘤細胞中都存在高表達[35]。王琳琳等[36]構建2個針對人源的siRNA的表達質粒，用脂質體介導，體外轉染人惡性黑色素瘤A375細胞株，使人惡性黑色素瘤A375細胞凋亡增加，結果表明siRNA-2表達沉默Livin基因后人惡性黑色素瘤A375細胞周期出現G0/G1期的細胞增多，進入S期的細胞減少，A375細胞周期阻滯于G0/G1期，細胞增殖受到抑制，腫瘤細胞凋亡增加。

總之，RNAi能對特定基因復制表達進行高效的抑制，而對其他無關基因沒有影響，因此這種方法針對性強，有很好的靶向性，不良反應小，在人類惡性腫瘤治療方面有廣闊的治療前景。但是RNAi技術不能使所有致病基因的沉默都能達到理想效果，如何提高基因沉默的效果對該種治療方法的有效性和可行性顯得尤為重要。而且在RNAi導入后其在人體內的穩定性和作用的長期性仍需進一步完善。目前的RNAi實驗大多數是在細胞和動物水平，關于人類的RNAi的臨床研究還很少，因此還缺乏對其不良反應的認識和研究。但是，相信在不久的將來，關于RNAi的諸多問題會逐步得到解決，RNAi將會廣泛地應用于臨床工作中，以挽救廣大惡性腫瘤患者的生命。

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(本文編輯：劉斯靜)

2016-10-27；

2017-03-11

國家自然科學基金資助項目(30440086)

王正想(1982-)，男，河北滄州人，河北滄州市中心醫院皮膚科主治醫師，醫學碩士，從事皮膚疾病診治研究。

R394

A

1007-3205(2017)08-0988-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.031

*通訊作者