p66shc基因表達(dá)與老年糖尿病患者早期腎損傷的相關(guān)性

石 晶 曹 喆 賈 琳

(武漢市中心醫(yī)院綜合科，湖北 武漢 430014)

p66shc基因表達(dá)與老年糖尿病患者早期腎損傷的相關(guān)性

石 晶 曹 喆1賈 琳2

(武漢市中心醫(yī)院綜合科，湖北 武漢 430014)

目的 研究p66shc基因在老年糖尿病患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及其與早期腎損傷指標(biāo)的關(guān)系。方法 采用實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測(cè)74例老年糖尿病患者和48例健康老年人(對(duì)照組)外周血單核細(xì)胞中p66shc基因表達(dá)水平，結(jié)合臨床資料分析p66shc與早期腎損傷指標(biāo)尿微量白蛋白(mAlb)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、免疫球蛋白(IgG)、α1-微球蛋白(α1-MG)和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)之間的相關(guān)性。結(jié)果 p66shc基因在老年糖尿病患者中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；與對(duì)照組相比，老年糖尿病患者mAlb、TRF、IgG、α1-MG、NAG均顯著升高(均P<0.01)，并均與p66shc基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)。結(jié)論 p66shc與老年糖尿病患者早期腎損傷密切相關(guān)，可為老年糖尿病患者腎損傷的早期診斷提供新的依據(jù)。

p66shc；糖尿病；腎損傷

糖尿病腎病(DN)逐漸成為終末腎病的主要原因，尤其是老年糖尿病(DN)患者〔1〕。DN早期發(fā)現(xiàn)和治療對(duì)腎損傷的臨床用藥和治療效果具有重要指導(dǎo)意義，因此，研究老年DM患者早期腎損傷的分子機(jī)制對(duì)延緩腎衰竭尤為重要。細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生是腎損傷發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)基因p66shc的表達(dá)水平，探究其與常規(guī)腎損傷指標(biāo)尿微量白蛋白(mAlb)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(TRF)、免疫球蛋白(IgG)、α1-微球蛋白(α1-MG)、N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年10月至2014年7月我院就診的74例老年DM患者，男41例，女33例，平均年齡(66.38±6.69)歲，均確診為2型糖尿病，無(wú)泌尿系統(tǒng)和高血壓等疾病。另選取同期來(lái)我院體檢的健康老人48例作為對(duì)照組，男27例，女21例，平均年齡(64.32±5.38)歲。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離 清晨空腹采取靜脈血5 ml，采用美國(guó)Sigma公司1077淋巴細(xì)胞分離液分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，將稀釋的血液沿管壁緩緩加入裝有分離液的15 ml離心管中，室溫2 000 r/min離心20 min，輕輕吸出云霧狀單個(gè)核細(xì)胞層，洗滌后加入1 ml Trizol重懸，于-80℃冰箱保存。

1.3 實(shí)時(shí)PCR檢測(cè) p66shc基因表達(dá) 采用Trizol法提取單核細(xì)胞總RNA，Trizol裂解的細(xì)胞于冰上融化，加入0.2 ml氯仿，震蕩15 s，靜置2 min，4℃條件下12 000 r/min離心15 min，取上清；加入0.5 ml異丙醇并輕輕混勻，靜置10 min，4℃離心，12 000 r/min×10 min，棄上清；加入1 ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4℃，7 500 r/min×5 min，棄上清；在室溫中放置10 min晾干，用30 μl無(wú)RNA酶的ddH2O于65℃促溶。使用Takara公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。Real time PCR采用Takara公司SYBR熒光定量PCR試劑盒(RR820A)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，采用20 μl體系，每個(gè)體系中模板1 μl，上下游引物各0.8 μl，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。引物由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成，p66shc上游引物：5'-GAAGAGCCACCTGACCATC - 3'，下游引物：5'-AGGCACCCGAAGAGCATC-3'；β-actin上游引物：5'-CGTGAAAAGACCCAGATCA-3'；β-actin下游引物：5'-CACAGCCTGGATGGCTACGT-3'。 實(shí)時(shí)PCR使用兩步法：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)，使用AB公司7500熒光定量PCR儀。結(jié)果采用ΔΔCt法對(duì)p66shc mRNA表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量。

1.4 腎損傷指標(biāo)的檢測(cè) mAlb使用挪威特種蛋白分析儀及配套試劑檢測(cè)。TRF、IgG和α1-MG采用美國(guó)Beckman公司Array 360 自動(dòng)蛋白分析儀及配套試劑檢測(cè)。 NAG采用終點(diǎn)比色法測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司，檢測(cè)方法嚴(yán)格按說(shuō)明書操作，使用儀器為日本島津7200全自動(dòng)生化分析儀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，相關(guān)性使用Pearson分析。

2 結(jié) 果

2.1 p66shc基因在對(duì)照組和老年DM患者中的表達(dá) p66shc在對(duì)照組中表達(dá)水平較低(1.09±0.26)，在老年DM患者中高表達(dá)(5.18±1.18)，其表達(dá)量是對(duì)照組的3～8倍(P<0.05)。

2.2 老年DM患者早期腎損傷指標(biāo)的檢測(cè) 與對(duì)照組相比，老年DM患者早期腎損傷指標(biāo)mAIb、TRF、IgG、α1-MG和NAG均顯著升高(均P<0.01)，表明老年DM患者可能存在腎損傷和病變(表1)。

表1 各組腎損傷指標(biāo)比較±s)

2.3 老年DM患者p66shc基因的表達(dá)與早期腎損傷指標(biāo)的相關(guān)性 在74例老年DM患者中，p66shc基因表達(dá)與mAlb(r=0.316,P=0.006)、TRF(r=0.286,P=0.013)、IgG(r=0.338,P=0.003)、α1-MG(r=0.370,P=0.001)和NAG(r=0.317,P=0.006)水平均呈正相關(guān)。p66shc基因表達(dá)與α1-MG水平的相關(guān)性最為密切，R2=0.137。

3 討 論

糖尿病腎病(DN)是老年DM患者的常見并發(fā)癥之一，也是老年DM患者死亡的主要原因。30 %的1型糖尿病患者，15 %的2型糖尿病患者可并發(fā)DN，引起終末期腎衰竭〔2〕。DN的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，是綜合遺傳特征在內(nèi)的多因素綜合作用的結(jié)果。目前認(rèn)為長(zhǎng)期高糖環(huán)境引起的細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的活性氧(ROS)增加、氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡，與DN的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。p66Shc是細(xì)胞氧化應(yīng)激和生命周期調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，由原癌基因ShcA編碼。p66Shc蛋白由N末端磷酸化酪氨酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域(PTB)、C端Src同源2區(qū)(SH2)、中央富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(CH1)和脯氨酸結(jié)構(gòu)域(CH2)組成，其中CH2結(jié)構(gòu)域在p66shc調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和凋亡中具有重要作用〔3〕。Shc蛋白廣泛表達(dá)于腦以外的多種組織細(xì)胞。正常情況下，p66shc主要分布于胞質(zhì)，應(yīng)激條件下p66shc發(fā)生磷酸化，由胞質(zhì)轉(zhuǎn)入線粒體，通過細(xì)胞色素C途徑引起細(xì)胞氧化損傷并激活凋亡信號(hào)，活化caspase-3引起細(xì)胞凋亡〔4〕。p66shc引起的氧化應(yīng)激在心血管疾病、糖尿病的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。Sun等〔5〕發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病小鼠模型中，腎組織中p66Shc表達(dá)水平顯著升高，其蛋白磷酸化水平也明顯增強(qiáng)。本文結(jié)果證實(shí)p66shc與DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

ROS的產(chǎn)生與胰島素抵抗、β細(xì)胞功能紊亂關(guān)系密切，也是糖尿病并發(fā)癥的啟動(dòng)因子〔6〕。多項(xiàng)研究報(bào)道〔7,8〕，p66shc的缺失可以降低多種細(xì)胞(如腎小管上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞)ROS的產(chǎn)生，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡。越來(lái)越多的研究表明，p66shc介導(dǎo)的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡與DM并發(fā)癥密切相關(guān)〔9〕。體外研究發(fā)現(xiàn)〔10〕，高糖可以誘導(dǎo)心臟干細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，并發(fā)生凋亡；而從p66shc-/-小鼠體內(nèi)分離的細(xì)胞凋亡情況明顯減弱。眼球內(nèi)注射 p66shc siRNA可以延緩氧化應(yīng)激導(dǎo)致的視網(wǎng)膜功能下降〔11〕。這些研究提示p66shc在DM心血管并發(fā)癥和視網(wǎng)膜細(xì)胞氧化損傷過程中發(fā)揮重要作用。本研究提示p66shc的表達(dá)水平與老年DM患者的腎損傷程度呈正相關(guān)。

1 Liang S,Li Q,Zhu HY,etal.Clinical factors associated with the diagnosis and progression of diabetic nephropathy〔J〕.Cell Biochem Biophys,2014;70(1):9-15.

2 聶 靜,孫 林,劉伏友.銜接蛋白p66Shc在糖尿病及其并發(fā)癥中的作用〔J〕.國(guó)際病理科學(xué)與臨床雜志,2009;29(3):250-3.

3 Camici GG,Cosentino F,Tanner FC,etal.The role of p66Shc deletion in age-associated arterial dysfunction and disease states〔J〕.J Appl Physiol,2008;105(5):1628-31.

4 Trinei M,Migliaccio E,Bernardi P,etal.p66Shc,mitochondria and the generation of reactive oxygen species〔J〕.Method Enzymol,2013;528(1):99-110.

5 Sun L,Xiao L,Nie J,etal.p66Shc mediates high-glucose and angiotensin Ⅱ-induced oxidative stress renal tubular injury via mitochondrial-dependent apoptotic pathway〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2010;299(5):F1014-25.

6 Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications〔J〕.Nature,2001;414(6865):813-20.

7 Arany I,Clark JS,Reed D,etal.The role of p66shc in taxol- and dichloroacetic acid-dependent renal toxicity〔J〕.Anticancer Res,2013;33(8):3119-22.

8 Frijhoff J,Dagnell M,Augsten M,etal.The mitochondrial reactive oxygen species regulator p66Shc controls PDGF-induced signaling and migration through protein tyrosine phosphatase oxidation〔J〕.Free Radical Biol Med,2014;68(6):268-77.

9 De Marchi E,Baldassari F,Bononi A,etal.Oxidative stress in cardiovascular diseases and obesity:role of p66Shc and protein kinase C〔J〕.Oxidat Med Cell Long,2013;2013:564961.

10 Rota M,LeCapitaine N,Hosoda T,etal.Diabetes promotes cardiac stem cell aging and heart failure,which are prevented by deletion of the p66shc gene〔J〕?Circ Res,2006;99(1):42-52.

11 Wu Z,Rogers B,Kachi S,etal.Reduction of p66Shc suppresses oxidative damage in retinal pigmented epithelial cells and retina〔J〕.J Cell Physiol,2006;209(3):996-1005.

〔2015-09-10修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

曹 喆(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病研究。

石 晶(1982-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事糖尿病研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)03-0603-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.034

1 心內(nèi)科 2 腎內(nèi)科