長托寧對大鼠脊神經結扎所致神經病理性疼痛模型的影響

陳功+馮濤

【摘要】 目的：探討長托寧對大鼠脊神經結扎所致神經病理性疼痛模型的影響。方法：清潔級SD雄性大鼠60只，6～8周齡，質量150～180 g，采用隨機數字表法，將其分為三組，假手術組（S組）、對照組（C組）和長托寧組（P組），每組各20只。假手術組分離暴露腰五神經但不結扎；對照組結扎腰五神經；長托寧組術前肌注長托寧0.07 mg/kg，結扎腰五神經，術后肌注長托寧0.07 mg/（kg·d），連續6 d。術后第7﹑32天進行機械性痛閾和熱痛閾檢測，取結扎處神經組織ELISA法檢測TNF-α和IL-6的水平。結果：術后第7天，C、P組術后機械性痛閾和熱痛閾均明顯低于S組（P<0.05），TNF-α和IL-6的水平均明顯高于S組（P<0.05）；P組術后機械性痛閾和熱痛閾均明顯高于C組（P<0.05），TNF-α和IL-6的水平均明顯低于C組（P<0.05）。術后第32天，C、P組各項指標比較差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：長托寧在神經損傷早期給予，能延緩神經損傷引起的病理性疼痛的發生發展過程，其機制可能與長托寧能改善受損組織局部的微循環，減輕炎癥反應的作用有關。

【關鍵詞】 長托寧； 神經病理性疼痛； 機械性痛閾； 熱痛閾

【Abstract】 Objective： To investigate the effects of Penehyclidine hydrochloride on rats neuropathic pain induced by spinal nerve ligation model.Method：Clean levels 30 male SD rats，6～8 weeks of age，150 to 180 g， were randomly divided into 3 groups，sham operation group （S group），control group （C group） and penehyclidine hydrochloride group （P group），20 rats in each group.The S group was exposed but not ligated five lumbar nerve；the C group was ligated five lumbar nerve；P group preoperative intramuscular injection of Penehyclidine hydrochloride 0.07 mg/kg，ligated five lumbar nerve ligation，after intramuscular injection of Penehyclidine hydrochloride 0.07 mg/（kg·d） for 6 days.The mechanical pain threshold and heat pain threshold were detected seventh days after operation，the ligation of nerve tissue TNF-α and IL-6 levels were detected by ELISA method.Result：Seventh days after operation，C group and P group after mechanical pain threshold and heat pain threshold was significantly lower than that of group S（P<0.05），TNF-α and IL-6 levels were significantly higher than that in S group（P<0.05）；P group after mechanical pain threshold and heat pain threshold were significantly higher than that in C group（P<0.05），TNF-α and IL-6 were significantly lower than C group.After thirty-second days，there was no significant difference between the C group and P group（P>0.05）.Conclusion：Penehyclidine hydrochloride in nerve injury early，can delay the occurrence and development process of neuropathic pain caused by nerve injury.The mechanism may be related to penehyclidine hydrochloride can improve microcirculation damaged tissues， reduce the inflammatory reaction.

【Key words】 Penehyclidine hydrochloride； Neuropathic pain； Mechanical threshold； TWL

First-authors address：Baoan Central Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.34.007

神經病理性疼痛是指外周或中樞神經系統損傷后引起的疼痛綜合征，它的特點是機械性異常性疼痛和熱痛覺過敏[1]。鹽酸戊乙奎醚（penehyclidine hydrochloride，PHC）注射液，商品名為長托寧，為我國首創的新型抗膽堿藥，主要選擇性的阻斷M1、M3亞型膽堿受體，臨床應用中發現該藥在改善微循環中的作用較好[2]。本研究擬通過建立脊神經結扎的大鼠模型，觀察長托寧對神經病理性疼痛的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔Ⅱ級雄性SD大鼠，6～8周齡，質量150～180 g，由廣東醫科大學動物實驗中心提供。實驗室溫度為22～24 ℃，濕度40%～60%，周期光照8：00～20：00，所有處理遵照國際疼痛學會的倫理指導進行[3]。

1.2 主要試劑和儀器 長托寧由成都力思特制藥有限公司提供，批號030722；機械性痛閾刺激儀和熱輻射刺激儀購自中國醫學科學院生物醫學研究所；TNF-α和IL-6 ELISA法檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 模型制作 按照文獻[4]方法，大鼠腹腔注射3%水合氯醛2 mL深麻醉后，以兩側骼骨最高點連線與背部中線相交處偏左側切開皮膚，切口長約2 cm ，分離皮下組織及肌肉，找到腰六的橫突并移除，暴露腰四及腰五神經，小心分離腰五神經，用絲線扎緊，觀察無明顯活動出血后逐層縫合肌肉皮膚。術畢腹腔注射氨節青霉素防止術后感染，將大鼠置于飼養籠中，注意保溫，水和食物供應充足。

1.3.2 實驗分組 采用隨機數字表法將60只大鼠分為3組，假手術組（S組）、對照組（C組）和長托寧組（P組），每組各20只。假手術組分離暴露腰五神經但不結扎；對照組結扎腰五神經；長托寧組術前肌注長托寧0.07 mg/kg，結扎腰五神經，術后肌注長托寧0.07 mg/（kg·d），連續6 d。

1.4 觀察指標

1.4.1 機械性痛閾測定 將每組大鼠隨機分為兩組，每組10只，一組用于術后第7天觀察，另一組用于第32天觀察。采用Dixon[5]方法，將大鼠置入有機玻璃籠內，籠子的底部為小格子金屬網，在測試開始前，先讓大鼠在籠子內適應10 min。選取一組vonfrey纖毛（編號為3.65，3.87，4.10，4.31，4.52，4.74，4.92和5.16；分別對應0.45，0.74，1.26，2.04，3.31，5.50，8.32，和14.45 g）。從4.31號纖毛開始，用纖毛以垂直大鼠腳掌的方向刺激腳掌皮膚，力度以使纖毛微微彎曲為宜，刺激位置在大鼠第四第五腳趾之間的皮膚。大鼠在刺激當時或刺激結束時出現抬足認為陽性。如果出現陰性反應，繼續選用下一個克數大的纖毛。如果出現陽性反應，繼續選用下一個克數小的纖毛，以出現不同的反應為始，連續測6次，并記錄結果。如果大鼠出現連續的陽性或陰性反應，直至0.45 g和14.45 g纖毛，那么按vonfrey編號，分別認定后一個編號5.28（18.72 g）或前一個編號3.54（0.34 g）為結果。

1.4.2 熱痛閾的測定 觀察大鼠在輻射熱照射下出現縮爪反射的潛伏時間作為熱痛閡。將每組大鼠隨機分為兩組，分別于術后第7﹑32天將大鼠放置于透明的有機玻璃籠中，籠子無底壁，將籠子放在一塊3 mm厚的玻璃板上，這樣動物的足底直接接觸玻璃板，而測定探頭緊挨著玻璃板的下面測定，減少系統誤差。照射源為8伏，50瓦的燈泡，內有凹透鏡聚焦，外罩金屬外殼，上端有一直徑5 mm的孔，這樣燈泡離前端為40 mm。探頭連接精確計時器，計時期與照射源電源同步，記錄開始照射到出現縮爪反應的時間區間。以大鼠在輻射熱照射下出現縮爪反射的潛伏時間作為熱痛閾，測定值精確到0.1 s，所有動物照射內側第一足趾的著力點，每個時點測定3次，間隔15 min/次，取平均值為熱痛閾。單次照射時間不超過20 s，以免損傷照射部位[6]，所有測定由一個不知情的實驗人員在相同時間點和相同實驗條件下完成。

1.4.3 TNF-α和IL-6的檢測 進行熱痛閾和機械性痛閾測定后，處死大鼠，取出結扎處腰五神經，用4 ℃生理鹽水制成1%勻漿，按ELISA法操作說明，檢測TNF-α和IL-6的水平。

1.5 統計學處理 使用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

術后第7天，與S組比較，C、P組機械性痛閾和熱痛閾均明顯降低（P<0.01），TNF-α和IL-6水平均明顯升高（P<0.01）；與C組比較，P組機械性痛閾和熱痛閾均明顯升高（P<0.05），TNF-α和IL-6水平均明顯降低（P<0.05）。術后第32天，C、P組機械性痛閾和熱痛閾均較S組明顯降低（P<0.01），而C、P組機械性痛閾、熱痛閾、TNF-α和IL-6水平比較差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1、2。

3 討論

神經病理性疼痛的發病機制并沒有完全清楚，目前還沒有好的治療方法。研究發現，炎癥反應在神經病理性疼痛的發生發展過程中起著重要作用[7]。在外周神經結扎后，華勒氏變性導致TNF-α生成，TNF-α是一種強有力的炎癥介質，可激發中性粒細胞表達大量粘附分子，促進單核巨噬細胞分化，使其發生氧化爆發、脫顆粒、增強其吞噬功能，還可進一步誘導自身和其他細胞因子（如IL-1、lL-6、IL-8等）的產生和釋放，導致神經損傷的加重[8-10]。外周神經損傷后產生的機械疼閾異常和熱痛覺過敏與受損部位或背根神經節神經元自發和持續性地異常放電密切相關。外周神經損傷引起的炎性物質引起這種異常放電增加，進一步加重疼痛的產生[11-12]。

局部組織損傷后的炎癥反應和疼痛引起的血小板聚集和炎癥細胞浸潤將導致血液粘稠度增加，導致微循環障礙。而微循環障礙進一步加重局部組織的缺血缺氧，從而加重損傷[13]。長托寧屬于抗膽堿藥物，與其他M膽堿受體阻斷藥物有相似的改善微循環障礙的作用，能夠緩解血瘀癥狀[14-15]。

本研究顯示，脊神經結扎后第7天，連續給予長托寧的P組相對于未給予長托寧的C組，其神經中TNF-α和IL-6水平明顯降低，機械性痛閾異常和熱痛閾過敏的現象得到明顯改善，說明長托寧能減輕炎癥反應，減輕神經損傷。在術后第32天，再次對各組大鼠進行觀察時，筆者發現P組和C組炎癥因子TNF-α和IL-6水平已大幅降低，兩組之間各項指標比較差異均無統計學意義（P>0.05）。其原因，筆者分析可能有兩點：第一：長托寧只在術后6 d連續給予，以后其作用慢慢消失；第二：長托寧雖然能改善受損組織局部的微循環，減輕炎癥反應，延緩神經病理性疼痛的發生發展過程，但并不能改善神經的損傷程度。具體原因，有待進一步實驗驗證。

綜上所述，筆者認為長托寧在神經損傷早期給予，雖不能減輕神經損傷引起的病理性疼痛，但能在一定程度上延緩神經病理性疼痛的發生發展過程。其機制可能與長托寧能改善受損組織局部的微循環，減輕炎癥反應的作用有關。

參考文獻

[1]丘玥，陳唯韞，王之遙，等.辛伐他汀對大鼠神經病理性疼痛行為學和RhoA通路表達的影響[J].中國疼痛醫學雜志，2016，22（7）：493-500.

[2]郭立峰.霧化吸入長托寧對COPD患者肺功能和微循環的影響[J].山東醫藥，2012，52（26）：83-84.

[3] Zimmermann M.Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals[J].Pain，1983，16（2）：109-110.

[4] Kim S H，Chung J M.An experimental model for Peripheral Neuropathy Produced by segmental spinal nerve ligation in the rat[J].Pain，1992，50（3）：355-363.

[5] Dixon W J.Efficient analysis of experimental observations[J].Annu Rev Pharmacol Toxieol，1980，20（20）：441-462.

[6] Hargreaves K，Dubner R，Brown F.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia[J].Pain，1988，32（l）：77-88.

[7]鐘敏，曾因明，柳垂亮，等.脊髓TNF-α、IL-1β和IL-6在神經病理性疼痛過程中的表達變化[J].中國疼痛醫學雜志，2010，16（1）：42-44.

[8]梅厚連，羅天友.強痛定聯合對乙酰氨基酚對神經病理性疼痛大鼠模型促炎因子的影響[J].中國醫藥導報，2013，10（19）：34-36.

[9]楊建軍，沈錦春，劉紅軍，等.加巴噴丁治療大鼠腰5神經結扎后神經病理性疼痛的療效及可能機制[J].醫學研究生學報，2010，23（5）：465-469.

[10]南興東，馮藝，張利萍.TNF-α在坐骨神經冷凍致神經病理性疼痛模型大鼠脊髓的表達[J].中國疼痛醫學雜志，2012，18（1）：38-42.

[11]徐江濤，馬柯.神經病理性疼痛中背根神經節交感神經芽生的機制研究[J].中國疼痛醫學雜志，2015，21（7）：481-485.

[12] Roza C，Laird J M，Souslova V，et al.The tetrodotoxin resistant Na+ channel Navl.8 is essential for the expression of spontaneous activity in damaged sensory axons of mice[J].J Physiol，2003，550（3）：921-926.

[13]趙麗倩，畢勝利.細胞黏附分子在危重病微循環障礙中的作用[J].微循環學雜志，2014，24（1）：68-70.

[14]周開隆，何文真，李其斌，等.鹽酸戊乙奎醚對大白兔耳微循環的影響[J].蛇志，2011，23（1）：9-10.

[15]董航，劉楊震，宇李霞，等.麻醉前應用新型抗膽堿藥物對失血大鼠腸系膜微循環改變的影響[J].微循環學雜志，2015，25（2）：12-14.