虎杖苷抑制高糖引起新生鼠心肌細胞鈣漏流的作用及其機制研究

陳澤龍　余懷新　陳淑娟　劉君英　劉文娟　鄧建新　閻德文

[摘要] 目的 研究虎杖苷（polydatin，PD）抑制高糖引起心肌細胞局部鈣信號紊亂的機制，探討其對糖尿病心肌病的保護作用。 方法 分離1～3 d SD大鼠乳鼠心肌細胞，隨機分為四組：對照組、高糖組、虎杖苷組和高糖+虎杖苷組。培養48 h后采用激光共聚焦顯微成像技術檢測局部鈣釋放單位鈣火花發放頻率及其形態；利用Western blot方法檢測受磷蛋白PLB和肌漿網SERCA 2a蛋白的表達水平。 結果 高糖組心肌細胞鈣自發鈣火花發放水平顯著增加（P<0.01），且略微增加鈣火花時程。在虎杖苷組中，高糖引起的高頻鈣火花發放顯著抑制（P<0.01）。與對照組相比，高糖增加心肌細胞內靜息期細胞內鈣離子水平，給予PD治療則抑制高糖引起鈣超載。PD抑制高糖引起的心肌細胞ROS水平增加。高糖下調PLB和SERCA 2a蛋白的表達。 結論 PD通過降低細胞自發鈣火花的頻率，抑制肌漿網鈣漏流、增加鈣穩定性，調節PLB/SERCA 2a蛋白比例，從而有效糾正高糖所致心肌細胞局部鈣調控紊亂。因此，PD可能在糖尿病心肌病患者中發揮著重要的心肌保護作用。

[關鍵詞] 虎杖苷；高糖；心肌細胞；鈣漏流；鈣火花

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）30-0020-04

虎杖苷是從傳統中藥虎杖（Polygonum Cuspidatun Sieb.et Zucc）中提取的單體，因其化學結構為白黎蘆醇與葡萄糖的結合產物，故又稱白黎蘆醇苷（piceid），屬羥基二苯乙烯類化合物。研究發現虎杖苷具有多種生物活性，尤其對心腦血管系統具有獨特的改善效果。

隨著糖尿病發病的日益流行，獨立于冠狀動脈粥樣硬化之外的糖尿病心肌病，其發病比例顯著增高。其中無癥狀性左室舒張功能不全是2型糖尿病心肌病的早期病變，隨著疾病進展，左室收縮期功能受損，最終導致心衰發生。研究表明糖尿病患者70%以上死于心血管疾病，是非糖尿病人群心血管系統疾病病死率2～3倍。故深入研究糖尿病心肌病的發病機制，為早期保護心臟功能，提高糖尿病患者生活質量，尤為重要[1，2]。糖尿病患者多伴隨有高血糖，長期的高血糖帶來的危害是持續、多面性的。然而高血糖對心肌細胞局部鈣信號的調控仍不清楚。因此，本研究探明高糖對心肌細胞的局部鈣信號的調控，并探討虎杖苷糾正高糖引起心肌細胞鈣紊亂的作用及其機制。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

1～3 d SD大鼠乳鼠20只，從廣東省實驗動物中心購買，動物許可證號：SCXK（粵）2013-0002。虎杖苷由深圳海王生物有限公司提供；抗SERCA蛋白抗體（Ab1）、PLB抗體購于美國Alomone公司；蛋白質測定試劑盒購于Bio-Rad公司；ECL檢測試劑盒購于Invitrogen公司；膠原酶Ⅱ購于Worthington公司；5-溴脫氧尿嘧啶和胰蛋白酶（Sigma，美國）；DMEM培養基（Gibco，美國）；新生牛血清（NBCS）為Gibco；Fluo-4 AM和H2DCFDA購于Invitrogen公司，其余無特別說明為國產分析純。主要的實驗儀器為：Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國）。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌細胞的原代培養 采用胰蛋白酶消化的方法分離乳鼠心肌細胞[3]。取 1～3 d 齡SD大鼠，在無菌條件下開胸，采用眼科鑷快速取下心臟并置于冰冷的PBS緩沖液中清洗3次。取心尖部組織剪為1 mm3碎塊，再用PBS液清洗，以清除血細胞。加入0.08%濃度胰蛋白酶37℃水浴消化10 min，棄上清，剩余組織塊中加入混合消化酶（0.08%胰蛋白酶加 0.04%～0.06%Ⅱ型膠原酶等量加入的混合液）置37℃水浴消化5～10 min多次，將各次消化制成的細胞懸液合并后，通過150目孔徑的不銹鋼網濾過。將細胞懸液接種于60 mm培養板中，采取差速法貼壁心肌細胞：37℃，5% CO2培養箱中孵育1 h，分離純化心肌細胞。將純化的細胞按0.8×105/m2～1.0×105/m2的密度接種于35 mm培養皿中。

1.2.2 分組 細胞被隨機分成四組：對照組（Control）、高糖組（High glucose，HG）、虎杖苷組（polydatin，PD）和高糖+虎杖苷組（HG+PD）。對照組給予甘露醇25 mM，高糖組給予25 mM葡萄糖，虎杖苷組給予30 μM PD +25 mM甘露醇，高糖+虎杖苷組給予30 μMPD+25 mM D-Glu，培養48 h后進行鈣信號檢測和Western blot檢測。

1.2.3 熒光染料的加載 在室溫下避光下把鈣熒光指示劑Fluo-4 AM（5 μmol/L）與細胞共同孵育8 min。染色后將細胞置于Zeiss LSM-780 倒置共聚焦顯微鏡系統的載物臺上，并灌以臺氏液。

1.2.4 鈣火花的采集 采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡線掃描方式，在400倍鏡下，選取合適的細胞、保持相同采樣速率為3.84 ms/線，連續采集1000條線。在采集過程中放大倍數和采樣速度應盡量保持一致，以方便后期的數據統計分析。激發光波長為488 nm，收集波長為505 nm以上的發射光。

1.2.5 ROS的檢測 細胞內ROS水平采用2，7-dichlorodihydro fluorescein diacetate（H2DCFDA）熒光探針進行檢測。在室溫下將細胞和熒光探針（10 μM）共同孵育10 min。采用Zeiss LSM-780倒置共聚焦顯微鏡面掃描的方式，激發光波長為488 nm，收集波長為505 nm以上的發射光。為了保持結果的可比性，熒光探針的加載條件和熒光的采集條件需要完全一致。

1.3 統計學處理

鈣火花圖像和ROS信號的處理及分析采用IDL 6.3（Research Systems，Inc.，Boulder，CO）軟件進行分析[4]。數據分析采用SPSS 13.0統計學軟件，統計方法為單向方差分析，方差齊時采用LSD法，方差不齊時組間比較采用Welch檢驗。統計結果以均數±標準差（x±s）表示，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 虎杖苷抑制高糖導致的心肌細胞鈣漏流

結果顯示（圖1B），高糖引起的心肌細胞自發鈣火花發放頻率顯著增加，由對照組的（1.69±0.07）增加到高糖組的（4.26±0.27），（t=-1.309，P<0.01）；PD組稍微增加鈣火花的發放頻率（1.89±0.08），（vs 對照組：P<0.05）；通過給予PD治療后可以抑制由高糖引起的鈣火花發放頻率，由HG組的（4.26±0.27）降為（2.48±0.15），（P<0.01）。對鈣火花的形態特性進一步分析見圖1C～F，高糖組鈣火花的幅度（F/F0）減小（vs 對照組：2.19±0.03 vs 2.32±0.05，P<0.05），持續時程（full-duration of half maximum，FDHM）延長（vs 對照組：40.06±0.94 vs 32.41±1.57，t=2.152，P<0.05），而不改變鈣火花的寬度（full-width of half maximum，FWHM）。

2.2 PD抑制高糖引起的心肌細胞鈣超載

在細胞的染色條件和所有的采集參數保持一致，采用激光共聚焦線掃描的方式，對四組心肌細胞靜息期細胞內鈣水平進行檢測。結果顯示：高糖引起心肌細胞的靜息鈣水平顯著性升高，從對照組的（50.12±2.24）（n=100）升高到（70.53±3.54）（n=125），（t=-3.727，P<0.01）。給予PD治療后，高糖引起的心肌細胞鈣超載得到有效恢復（61.28±3.31）（n=200）[vs高糖組的（70.53±3.54）（n=125），P<0.05]（圖2）。

2.3 PD恢復高糖引起的心肌細胞ROS增加

與對照組的熒光值（56.13±3.24）相比，高糖培養心肌細胞48 h后，高糖組心肌細胞產生的ROS水平顯著增高（98.13±6.32，t=4.923，P<0.01）。當給予PD治療后，HG+PD組的心肌細胞ROS顯著降低（vs 高糖組：64.28±5.31，t=3.336，P<0.01），單純的PD組則不影響心肌細胞的ROS水平。

2.4高糖抑制受磷蛋白PLB和SERCA 2a蛋白的表達

如圖4B、C顯示，與對照組相比，高糖使得PLB蛋白表達有所降低（0.77±0.05 vs 0.98±0.04，t=-1.995，P<0.05，n=5）；同時對SERCA 2a蛋白水平也有下調作用（0.58±0.05 vs 1.03±0.03，t=-3.988，P<0.01，n=5）；但是高糖對SERCA 2a蛋白的抑制作用更為明顯，PLB/SERCA 2A蛋白的比值有所升高（1.31±0.11 vs 0.96±0.04，t=3.023，P<0.01，n=5）（圖4D）。給予PD治療后，PLB蛋白和SERCA 2a蛋白的表達有所恢復。

3 討論

鈣離子作為細胞第二信使，在心肌細胞的興奮收縮偶聯（E-C coupling）中起著不可或缺的作用。心肌細胞對鈣離子復雜而又精細的調控，維持細胞內鈣離子濃度的動態平衡，從而保證細胞正常的舒縮功能。一旦鈣離子的動態平衡被打亂，心臟功能甚至結構都可能發生異常。糖尿病是胰島素分泌相對或絕對不足，并以高血糖、高血脂為特征的代謝紊亂綜合征。研究表明，高糖血癥會導致晚期糖基化終末產物（AGEs）和活性氧化產物（ROS）的增加[5]、激活 RAS系統，致脂質、蛋白、核酸損傷，相應的氧化應激產物增多，另外，高糖可致抗氧化系統的相關酶活性如SOD、過氧化氫酶的活性下降[6，7]。長期高糖血癥導致心肌細胞能量代謝異常通路激活、氧化應激壓力增加和線粒體功能異常，引起心肌細胞鈣超載，即靜息期胞漿鈣離子濃度升高，可能是導致心肌功能障礙的重要原因[8-11]。

虎杖苷，是從傳統中藥虎杖中提取的單體，具有抗血栓、抗氧化、降血糖、抗休克、調節蛋白激酶等廣泛的生物學效應[12]。在本課題組之前的系列研究中發現，PD具有很好的心血管保護作用，可以減緩肥大、防治燒傷后心功能的損傷的功效[13，14]。本研究中發現，PD通過改變鈣火花發放頻率和鈣火花形態學，顯著抑制高糖引起的心肌細胞鈣超載，進而減少肌漿網鈣漏流的發生，增加鈣穩定性，進一步豐富了PD在心血管保護中的作用機制。

引起心肌細胞鈣超載的原因不是單一因素，肌漿網中的鈣泵 SERCA 2a 活性和功能影響著鈣回收的效果。有實驗報道，心衰時SERCA 2a 活性明顯下降，同時伴有Ca2+攝取減少，胞質內Ca2+聚集，影響心臟的舒張功能[15]。受磷蛋白對SERCA 2a起著調控的作用，PLB 在非磷酸化狀態下抑制SERCA 2a的活性，從而抑制SERCA 2a攝取Ca2+，PLB磷酸化可逆轉這一抑制作用[16]。當PLB/SERCA 2a比值升高時，SERCA 2a和Ca2+的親和力下降，心肌細胞舒縮功能受損。在本研究中，我們發現，高糖刺激使得SERCA 2a和PLB表達均下降，但SERCA 2a降低更為顯著，PLB/SERCA 2a比值升高，從而引起鈣泵的功能受損，引起心肌細胞的鈣超載。

近年來大量研究表明，氧化應激是糖尿病心肌病發生、發展的重要病理生理學基礎，抗氧化可以抑制糖尿病心肌病的進展，改善心功能。本研究中發現，PD通過抑制高糖引起的心肌細胞ROS增加，恢復SERCA 2a和PLB表達水平，提示糖尿病心肌病時鈣調節蛋白表達異常可能與氧化應激損傷增強有關。

綜上所述，糖尿病心功能障礙的一個重要機制是SR鈣漏流增加及鈣調節蛋白表達異常。虎杖苷可以減少高糖引起的肌漿網鈣漏流，緩解心肌細胞鈣超載，增加心肌細胞鈣離子的穩定性；同時抑制氧化應激損傷、調節心肌細胞鈣調節蛋白表達，增加心功能，從而起到心肌保護作用。對于糖尿病心肌病患者，虎杖苷減少心肌漿網鈣漏流有可能是早期治療糖尿病心肌病的一個新的靶點。本研究提示虎杖苷可以抑制糖尿病心肌病的進展，改善心功能，為糖尿病心功能障礙的臨床治療提供實驗依據和新的思路。

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（收稿日期：2016-08-16）