參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MGC-803細胞增殖的影響

馬春林，吳紅彥，2，3，李海龍，2，陳杰，張宣，李紅亮

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫方藥挖掘和創新轉化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產品創制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MGC-803細胞增殖的影響

馬春林1，吳紅彥1，2，3，李海龍1，2，陳杰1，張宣1，李紅亮1

1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中醫方藥挖掘和創新轉化重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省中藥新產品創制工程實驗室，甘肅 蘭州 730000

目的觀察參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MGC-803細胞增殖的影響，探討其相關機制。方法以參芪抑瘤方不同濃度藥物血清干預胃癌MGC-803細胞后，MTT法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞周期，qRT-PCR檢測CDKN1B、CDKN1C基因表達，Western blot檢測p27、p57蛋白表達。結果3%、5%、10%藥物血清作用于MGC-803細胞24、48、72 h，細胞增殖水平顯著降低（P＜0.01），且與時間和劑量呈依賴關系；3%、5%、10%藥物血清作用于MGC-803細胞24 h后，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少；qRT-PCR檢測結果顯示，與對照組和空白血清組比較，藥物血清各劑量組MGC-803細胞CDKN1B、CDKN1C mRNA表達顯著上調（P＜0.01）；Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，藥物血清各劑量組MGC-803細胞p27、p57蛋白表達顯著上調（P＜0.01）。結論參芪抑瘤方藥物血清可抑制胃癌MGC-803細胞的增殖，其機制可能是通過調節CDKN1B、CDKN1C mRNA和蛋白表達，進而干預細胞周期。

參芪抑瘤方；藥物血清；胃癌細胞；細胞增殖；細胞周期

參芪抑瘤方臨床用于腫瘤的治療，具有益氣扶正、養血活血、化痰散結、清熱利濕、解毒散結、通絡止痛等功效。本實驗在前期研究的基礎上[1-3]，進一步探索優化后的組方——參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MGC-803細胞增殖的影響，探討其相關機制。

1 實驗材料

1.1 藥物

參芪抑瘤方（苦參、黃芪、當歸、貝母等），飲片由甘肅中醫藥大學附屬醫院提供，經甘肅中醫藥大學附屬醫院楊錫倉主任藥師鑒定符合2015年版《中華人民共和國藥典》規定。

1.2 細胞株

胃癌MGC-803細胞株受贈于甘肅省中醫方藥挖掘和創新轉化重點實驗室。

1.3 動物

SPF級SD雌性大鼠50只，6～8周齡，體質量（200±20）g，甘肅中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號2001000000198。飼養于室溫20～25 ℃、濕度45%～55%的清潔級實驗動物房，喂標準飼料，自由飲水。

1.4 試劑

DMEM高糖培養基（Gibco），四季青胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），胰蛋白酶（Gibco），噻唑藍（Sigma），二甲基亞砜（DMSO，Sigma)，反轉錄試劑盒（美國Roche），擴增試劑盒（韓國BIONEER），RIPA裂解液（北京普利萊基因技術有限公司），化學發光液（美國Thermo），一抗、二抗（艾菲生物技術有限公司）。

1.5 儀器

流式細胞儀（美國COULTER，EPICS XL），細胞培養箱（上海力申科學儀器有限公司，HF212），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS，CKX41+DP21），連續波長酶標儀（美國BIO-RAD），電泳槽、轉印槽及配套電源（美國BIO-RAD），CFX96型PCR儀、凝膠成像儀（美國BIO-RAD）。

2 實驗方法

2.1 中藥湯劑制備

采用傳統水煎方法。將稱好的藥材混合，先用10倍量水冷浸1 h，加熱，待煮沸后，再持續煎煮40 min，濾出煎液，剩余藥渣中再加6倍量水，至沸后繼續煎煮30 min，濾出煎液，2次煎液合并，70 ℃水浴濃縮至含原藥材5.7 g/mL水提液，4 ℃冰箱保存備用。

2.2 藥物血清制備

將50只SPF級SD大鼠隨機分為參芪抑瘤方組和空白組。給藥組按3 mL/200 g予5.7 g原藥材/mL湯劑灌胃（用藥量為人等效劑量5倍），空白組予等量飲用水灌胃，每日2次，連續7 d，于末次給藥1 h后，股動脈采血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，將所采2組血清分別混合，-80 ℃冷藏備用，臨用前56 ℃、30 min滅活。

2.3 細胞復蘇與培養

復蘇MGC-803胃癌細胞株，用含10%小牛血清DMEM培養液接種于無菌培養瓶中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中單層貼壁培養。待細胞鋪滿培養瓶底后，棄去培養液，0.25%胰蛋白酶消化，吹打成細胞懸液后接種傳代。

2.4 MTT法檢測細胞抑制率

取對數生長期細胞，制備成密度為5×104/mL細胞懸液，接種于96孔板中，使每孔加入的細胞懸液為100 μL，待細胞貼壁后，設對照組、空白血清組和參芪抑瘤方藥物血清低、中、高劑量組（藥物血清低、中、高劑量組），每組設6個復孔。對照組予常規培養液；空白血清組和藥物血清低、中、高劑量組予常規培養液的同時，每孔分別加非藥物大鼠血清20、10、6、0 μL和藥物大鼠血清0、6、10、20 μL，使各孔終體積為200 μL，各組所加大鼠血清占總培養液體積的10%。分別取經血清干預24、48、72 h的96孔培養板，每孔加5 g/L MTT 20 μL，繼續培養4 h后棄去培養基，每孔加DMSO 150 μL，搖床震蕩10 min，于酶標儀波長570 nm處測定吸光度（OD）值，計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）＝（對照孔OD值－給藥孔OD值）÷對照孔OD值×100%。

2.5 流式細胞儀檢測細胞周期

取對數生長期細胞接種于6孔板中，增殖為80%時，按“2.4”項分組，加入不同濃度的藥物血清處理24 h，檢測前用胰酶消化，1500 r/min離心5 min，吸棄上清液，PBS洗2次，70%乙醇固定，4 ℃過夜。用PBS配制成單細胞懸液，50 μg/mL碘化丙啶染色液室溫染色30 min，流式細胞儀分析細胞周期。

2.6 qRT-PCR檢測CDKN1B、CDKN1C基因表達

按Trizol法分別提取培養24 h后不同組別胃癌MGC-803細胞的總RNA，檢測純度后，用Takara反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，按試劑盒說明操作，-20 ℃保存備用。引物由寶生物工程（大連）有限公司合成，其序列見表1。按照熒光定量PCR試劑盒說明操作，擴增反應在CFX96 Real-Time熒光PCR儀上進行。分析融解曲線，確認擴增產物的特異性，以2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 PCR反應基因序列

2.7 Western blot檢測p27、p57蛋白表達

低溫下分別提取培養24 h后不同組別胃癌MGC-803細胞的蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，并把各組蛋白濃度調整一致，嚴格按試劑盒說明書進行操作。每孔上樣10 μL，15%聚丙烯酰胺凝膠100 V恒壓電泳分離約2 h；經200 mA、2 h轉至PVDF膜；含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h后，分別加入一抗p27（1∶500）、p57（1∶500）抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗2次，TBS洗1次×5 min；再用抗兔辣根過氧化物酶耦聯的二抗室溫孵育1 h，TBST洗2次，TBS洗1次×5 min；加ECL工作液，凝膠成像儀下曝光成像。運用ImageJ2X專業圖像軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

3 統計學方法

4 結果

4.1 參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MGC-803細胞增殖的影響

不同濃度參芪抑瘤方藥物血清對MGC-803細胞增殖有抑制作用，藥物血清組OD值明顯低于對照組。MGC-803細胞藥物血清干預24 h高、中、低劑量組細胞抑制率分別為31.43%、16.98%、5.84%，MGC-803細胞藥物血清干預48 h高、中、低劑量組抑制率分別為30.32%、22.67%、16.09%，MGC-803細胞藥物血清干預72 h高、中、低劑量組抑制率分別為41.06%、23.27%、17.63%（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組胃癌MGC-803細胞不同時點增殖水平比較（±s，OD值）

表2 各組胃癌MGC-803細胞不同時點增殖水平比較（±s，OD值）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 n 24 h 48 h 72 h對照組 6 1.05±0.03 1.26±0.02 0.91±0.04空白血清組 6 1.04±0.03 1.15±0.02 0.80±0.03藥物血清低劑量組 6 0.99±0.04*1.06±0.04*0.75±0.04**藥物血清中劑量組 6 0.87±0.04**0.97±0.05**0.70±0.02**藥物血清高劑量組 6 0.69±0.03**0.88±0.04**0.52±0.02**

4.2 參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MGC-803細胞周期的影響

不同濃度藥物血清處理MGC-803細胞24 h后，與對照組比較，低劑量組G0/G1期比例由41.8%上升至53.4%，S期比例由50.8%下降至33.2%；中劑量組G0/G1期比例由41.8%上升至59.2%，S期比例由50.8%下降到27.2%；高劑量組G0/G1期比例由41.8%上升至70.6%，S期比例由50.8%下降至15.3%。結果見表3、圖1。

表3 各組胃癌MGC-803細胞周期分布比較（%）

圖1 各組胃癌MGC-803細胞流式細胞圖

4.3 參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MGC-803細胞CDKN1B、CDKN1C基因表達的影響

參芪抑瘤方藥物血清干預胃癌MGC-803細胞24 h后，與對照組和空白血清組比較，藥物血清各劑量組抑癌基因CDKN1B、CDKN1C表達量明顯上調（P＜0.01）。結果見表4。

4.4 參芪抑瘤方藥物血清對胃癌MGC-803細胞p27、p57蛋白表達的影響

與對照組比較，藥物血清各劑量組p27、p57蛋白表達明顯增加（P＜0.01）。結果見表5、圖2。

表4 各組胃癌MGC-803細胞CDKN1B、CDKN1C mRNA表達比較（±s，2-ΔΔCt值）

表4 各組胃癌MGC-803細胞CDKN1B、CDKN1C mRNA表達比較（±s，2-ΔΔCt值）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白血清組比較，##P＜0.01

組別 n CDKN1B CDKN1C對照組 6 1.00±0.00 1.00±0.00空白血清組 6 1.27±0.19*1.44±0.22*藥物血清低劑量組 6 2.64±0.23**##2.57±0.29**##藥物血清中劑量組 6 4.27±0.34**##3.40±0.41**##藥物血清高劑量組 6 7.47±0.32**##9.67±0.20**##

表5 各組胃癌MGC-803細胞p27、p57蛋白表達比較（±s，平均灰度值）

表5 各組胃癌MGC-803細胞p27、p57蛋白表達比較（±s，平均灰度值）

注：與對照組比較，**P＜0.01；與空白血清組比較，##P＜0.01

組別 n p27 p57對照組 3 0.641±0.001 0.329±0.110空白血清組 3 0.614±0.006**0.571±0.024**藥物血清低劑量組 3 0.782±0.002**##0.613±0.001**藥物血清中劑量組 3 1.049±0.002**##0.838±0.083**##藥物血清高劑量組 3 1.267±0.008**##1.183±0.117**##

圖2 各組p27、p57蛋白表達免疫印跡電泳圖

5 討論

參芪抑瘤方由苦參、黃芪、當歸、貝母等組成，現代藥理研究表明，方中各味中藥有效成分對多種癌細胞均有明顯的抑制作用[4-6]。

CDKN1B即p27kip基因定位于染色體12p13上，外顯子和內顯子各2個，屬cip/kip家族成員之一，是重要的細胞周期素依賴激酶抑制因子，通過與細胞周期蛋白結合，產生對大多數Cyclin-CDK復合物（包括Cyclin E2-CDK在內）激酶活性的抑制作用，發揮負調控細胞周期的功能。而Cyclin E2很可能是細胞周期G1期的限速因子。p27kip既能抑制被激活Cyclin-CDK的活性，也可對CDK的激活過程進行干預，最終使細胞從G1期向S期的轉變受到抑制。

CDKN1C即p57kip2基因定位于染色體11p15.5上，也是cip/kip家族成員之一，屬細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子。在它的C末端有一核定位信號，近氨基末端有一介導細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制的保守區。它可以抑制某些G1期和S期激酶復合物，如Cyclin E-CDK2、Cyclin A-CDK2及Cyclin D-CDK2等，阻滯細胞由G1期向S期的轉變，停滯細胞于G1期，近而發揮負調控細胞周期的作用。

現代研究表明，胃癌組織p27kip1和p57kip2的陽性表達明顯低于正常胃組織，提示胃癌的發生可能與p27kip1和p57kip2蛋白的低表達或缺失有關[7-9]，其機理可能是胃癌組織p27kip蛋白表達降低，增加Cyclin-CDK2復合物的活性，加速細胞由G期向S期的過渡，促使細胞過度增殖而形成腫瘤；或是p57Kip2的缺乏導致Cyclin D/CDK6的聚集，Rb蛋白活性受到抑制，促使E2F因子的釋放，進而激活相關應答基因轉錄，細胞開始增殖，導致Cyclin E/CDK2激酶復合物的持續激活，加速細胞周期G1向S期的進程，導致Cyclin A/CDK2激酶復合物的持續激活，升高Cyclin A的表達水平，進而利于細胞更快地進入S期。

本研究結果表明，參芪抑瘤方藥物血清可抑制胃癌MGC-803細胞的增殖，且對胃癌MGC-803細胞由G1期向S期的轉化有一定阻滯作用，其機制可能是通過調節CDKN1B和1C的表達，促使其與細胞周期蛋白結合，抑制Cyclin-CDK2等復合物的活性，發揮負調控細胞周期的功能。

[1] 石金鳳,李海龍,吳紅彥,等.當歸貝母苦參丸含藥血清對胃癌細胞SGC-7901和侵襲轉移能力和周期的影響[J].遼寧中醫藥大學學報, 2014,16(10)：30-33.

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Effects of Medicinal Serum of Shenqi Yiliu Formula on Proliferation of Gastric Cancer MGC-803 Cells

MA Chun-lin1, WU Hong-yan1,2,3, LI Hai-long1,2, CHEN Jie1, ZHANG Xuan1, LI Hong-liang1
(1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. State Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Excavation Innovation and Transformation of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province, Lanzhou 730000, China)

ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of medicinal serum of Shenqi Yiliu Formula on cell proliferation of gastric cancer MGC-803 cells; To discuss relevant mechanism.MethodsAfter treated with different concentrations of medicinal serum of Shenqi Yiliu Formula, gastric cancer MGC-803 cells were tested by the following methods: MTT was employed to test the proliferation of gastric cancer MGC-803 cells; Flow cytometry was used to detect cell cycle; qRT-PCR was used to detect the genetic expressions of CDKN1B and CDKN1C; Western blot was employed to test the protein expressions of p27 and p57.ResultsWhen 3%, 5% and 10% medicinal serum of Shenqi Yiliu Formula was treated to MGC-803 cells for 24 h, 48 h and 72 h, proliferation of cells decreased significantly (P＜0.01), with time- and dosage-dependent relationship. When 3%, 5% and 10% medicinal serum of Shenqi Yiliu Formula was treated to MGC-803 cells for 24 h, cells in G0/G1 increased, decreased in S. qRT-PCR results showed that compared with the blank control group and the negative control group, mRNA expressions of CDKN1B and CDKN1C of MGC-803 cells in medicinal serum all dose group increased significantly (P＜0.01). Western blot results showed that compared with the blank control group, protein expressions of p27 and p57 of MGC-803 cells in medicinal serum all dose group increased significantly (P＜0.01).ConclusionMedicinal serum of Shenqi Yiliu Formula can inhibit MGC-803 cells proliferation and the mechanism may be through adjusting CDKN1B, CDKN1C mRNA and proteins expression to intervene in the cell cycle.

Shenqi Yiliu Formula; medicinal serum; gastric cancer cell; cell proliferation; cell cycle

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.03.013

R285.5

A

1005-5304(2017)03-0053-04

2016-04-07）

（

2016-04-24；編輯：華強）

甘肅中醫藥大學研究生創新基金（2015CX11）；蘭州市人才創新創業扶持項目（2015-RC-24）

吳紅彥，E-mail：wuhy@163.com