人工栽培蛹蟲草菌種培養液發酵生產工藝流程

焦子偉　陳方園　伍夢迪　馬麥燕　努爾買買提　孫清花

摘要 蛹蟲草是一種珍貴的藥（食）用真菌，其功效與野生的冬蟲夏草相似。目前已對蛹蟲草子實體進行了人工栽培研究與示范。為了大規模化對蛹蟲草子實體進行人工栽培，需要進行大量優質蛹蟲草菌種培養液配備。因此，在已有研究的基礎上，從優化發酵工藝方面入手，篩選出了最佳的發酵優化條件，提出了蛹蟲草菌種培養液發酵生產工藝的關鍵控制要點，并對蛹蟲草菌株種子液發酵生產中菌株活化、接種、液體搖培、發酵罐調試、發酵罐封裝滅菌、發酵培養、保存等方面提出了具體的、明確的技術要求，為批量制備蛹蟲草菌種培養液提供技術依據。

關鍵詞 蛹蟲草；人工栽培；種子液；擴大生產；工藝流程

中圖分類號 S567.35 文獻標識碼 B 文章編號 1007-5739（2016）21-0075-01

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種珍貴的藥（食）用真菌，寄生于鱗翅目昆蟲蛹體后能形成真菌與昆蟲復合體，屬子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲草屬，與冬蟲夏草（C.sinensis）同屬異種，故又名北冬蟲夏草、北蟲草、蛹草、蛹草菌等[1-4]。已有研究表明，蛹蟲草子實體中具有多種藥用成分如蟲草素、多糖和蟲草酸，具有滋肺益氣、增精益腎、止血化痰、抑制腫瘤、延緩衰老、增強免疫力等作用，并在市場上得到廣泛應用[5-6]。由于野生蛹蟲草大面積采挖已面臨枯竭，目前人工蛹蟲草已廣泛栽培，在蛹蟲草的人工栽培條件、化學成分組成、藥理作用、臨床醫療保健功效等方面取得了較大進展[6-7]。筆者也從新疆地區采集野生蛹蟲草子實體進行了分離得到優良菌株，進行了人工栽培研究與示范，也取得了較好的效果[8]。為了大規模化對蛹蟲草人工栽培，需要對批量優質蛹蟲草菌懸液進行制備，才能滿足擴大再生產需要。為此，筆者在已有實驗室裝備和研究的基礎上，從優化發酵工藝方面入手，對發酵罐中培養調節溫度、pH值、通氣量等因素進行了控制，篩選出了最佳的發酵優化條件，制備的種子液滿足擴大再生產的需要。現對蛹蟲草菌種培養液發酵生產工藝流程進行了總結，以期為批量制備蛹蟲草種子培養液提供技術依據。

1 供試菌株

供試菌株已經本實驗室經單子囊孢子分離，進行分子生物學鑒定與人工篩選，獲得了不同交配型MAT1-1和MAT1-2代表菌株[8-9]。

2 培養基制備

改良馬鈴薯（PDA）固體培養基[10]：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，瓊脂16 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）2 g，七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）1 g，復合VB 25 mg，用水補至1 000 mL，pH值 6.5～7.0。改良PD培養基（g/L）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨3 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂1 g，復合VB 25 mg，pH值6.5～7.0。種子發酵培養基采用改良PD培養基。

3 工藝流程

3.1 倒平板

將改良型PDA固體培養基加熱熔化，待溫度冷卻至55～60 ℃時在無菌操作下倒入已滅菌的培養皿中，培養基冷卻凝固后倒放備用。

3.2 活化

從冰箱中取出不同交配型MAT1-1和MAT1-2的蛹蟲草優良菌種，在無菌操作下分別接種于改良型PDA培養基上，恒溫培養箱21 ℃±1 ℃光照培養15～20 d，待菌株長至近培養皿邊緣時放置4 ℃冰箱備用。

3.3 接種

將長滿菌株的培養基從冰箱中取出，無菌條件下用滅菌牙簽挑取少量粉色的分生孢子，接種至裝有滅好菌的改良PD液體培養基的錐形瓶中。

3.4 液體搖培

將含有不同交配型的接種好的錐形瓶放在搖柜中進行搖培，170 r/min，（21±1） ℃下恒溫震蕩培養3～4 d，獲得許多含有小米粒的菌絲球的少量種子菌懸液。

3.5 種子液擴大生產

以LiFlus GX發酵罐為例，進行了蛹蟲草菌株種子液擴大生產，具體如下。

3.5.1 發酵罐調試。

（1）pH電極405-BPAS pH值校準。配制校準液（pH值分別為4.01和6.86），開機點主頁面的calibration.繼續pH calibration，先用蒸餾水潤洗點擊，再用餐巾紙擦拭，將配制好的標準液分別放入50 mL試管中，倒入15～20 mL即可。并將電極先后插入pH值6.86、pH值4.01的校準液中，靜置與校準。

（2）溶氧電極INPRO 6800溶氧電極準備。將溶氧電極的下端5 cm處電極頭旋開，用拇指蓋抵住電極頭下端金屬圈將其內部結構取出來。在取出來的內部結構中倒滿極化液，注意不能有氣泡，否則底部的膜會破。

3.5.2 發酵罐封裝滅菌。清洗發酵罐LiFlus GX各個部位，然后將各個電極安裝到發酵罐上，將適量酸、堿倒入瓶中，并注意用皮筋底部扎口，目的是防止腐蝕皮管和發酵罐。并將各個出口用封口膜緊緊封住，用報紙包住冷凝管滅菌，一般121 ℃滅菌15～20 min，完成后快速移到無菌操作臺下紫外滅菌30 min。

3.5.3 發酵培養。在無菌條件下按滅菌好的發酵培養基：種子菌懸液為10～15∶1（體積比）的比例倒入發酵罐，封好后移出。連接各個電極，開通各個電源，通過蠕動泵調節酸、堿通過皮管到達發酵罐并調成自動模式。設置發酵條件（溫度20～25 ℃，pH值6.0～6.5，通氣量1 mL/min），培養2～3 d，菌絲球布滿培養液，發酵完成。

3.5.4 種子液保存。對超凈工作臺滅菌30 min，將發酵完成的發酵罐移到超凈工作臺中，用酒精棉球擦拭整個發酵罐體，將菌種培養液倒入已預先滅菌好的玻璃容器內，并用標鑒標注時間、條件、工作人員等信息，放入4 ℃冰箱保存備用。

4 參考文獻

[1] KIRK P M，CANNON P F，DAVID J C，et al.Dictionary of Fungi[M].9th ed.wallingford oxon：CAB International，2001.

[2] 蔣三俊.冬蟲夏草及蛹蟲草寄主昆蟲資源[J].特種經濟動植物，2001（5）：15.

[3] 梁宗琦.中國真菌志：第32 卷：蟲草屬[M].北京：科學出版社，2007：1-19.

[4] ZHOU XW，GONG ZH，SU Y，et al.Cordyceps fungi：natural products，pharmacological functions and developmental products[J].Journal of Pha-rmacy and Pharmacology，2009，61：279-291.

[5] 孟澤彬，陳林會，朝近雨，等.蛹蟲草化學活性成分的研究[J].分子植物育種，2015（9）：2147-2154.

[6] 張姝，張永杰，SHRESTHA BHUSHAN，等.冬蟲夏草菌和蛹蟲草菌的研究現狀、問題及展望[J].菌物學報，2013，32（4）：577-597.

[7] SHRESTHA B，HAN S K，SUNG J M，et al.Fruiting body formation of Cordyceps militaris from ulti-ascospore isolates and their single ascosp-ore progeny strains[J].the Korean Society of Mycology，2012，40（2）：100-106.

[8] 努爾買買提，焦子偉，楊曉絨，等.不同人工栽培培養基對蛹蟲草子實體發育的影響及效益分析[J].新疆農業科學，2016，53（2）：359-366.

[9] ZHANG G，LIANG Y.Improvement of fruiting body production in Cordyceps mlitaris by molecular assessment[J].Archives of Microbiology，2013，195：579-585.

[10] 梁月，張國珍，安沫平，等.蛹蟲草子囊孢子萌發及其后代群體培養性狀觀察[J].菌物學報，2005，24（4）：525-532.