Genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯病毒檢測上的應用綜述

頡瑞霞　張小川　王效瑜　郭志乾　吳林科　余幫強　張國輝

摘要 生物芯片檢測技術是一種檢測速度快、靈敏度高、專一性強的新型病毒檢測技術。genetop馬鈴薯病毒試劑盒具有可同時檢測出7種病毒（PVY可分型PVY與PVYN）與1種類病毒，直接檢測薯塊，所用試劑無毒，操作簡便且病毒與類病毒全部檢測平均成本低于ELISA等特點。對genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及馬鈴薯種薯生產與質量控制體系中的應用前景進行了綜述。

關鍵詞 生物芯片檢測；馬鈴薯；病毒檢測

中圖分類號 S412 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）21-0104-01

生物芯片（Biochip）是20世紀90年代中期以來形成的最具深遠意義的重大科技進展之一[1]，目前主要應用在醫學和食品等領域[2]。近年來，生物芯片檢測技術是繼酶聯免疫吸附、免疫膠體金技術（ICG）和反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法應用之后，又一種利用核酸專一性，檢測速度快、靈敏度高、專一性強、操作簡便、結果易讀取的新型病毒檢測技術[3-7]。筆者就Genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及在馬鈴薯種薯生產中的應用前景進行綜述。

1 genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測的基本原理

genetop馬鈴薯病毒試劑盒是由臺灣巨合生物科技股份有限公司開發的新型馬鈴薯病毒生物芯片試劑，該試劑盒針對馬鈴薯病毒病中的核酸進行分子檢測，在生物芯片孔盤表面已預先植入8種馬鈴薯病毒之專一性探針，病毒核酸萃取后經由一步核酸反轉錄聚合酶連鎖反應，將馬鈴薯病毒特有的基因片段訊號放大，與芯片盤上的探針進行專一性結合；反應結果可利用肉眼直接判讀。genetop馬鈴薯病毒試劑盒主要包括核酸萃取（Virus RNA Extraction）、一步驟核酸反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR）以及核酸雜合反應（Hybridization），同時使用生物素與堿性磷酸酶系統的化學非放射性的呈色方法進行顯色，避光染色后，結果可利用肉眼直接讀取。該方法是進行定性檢測的一種有效方法。

2 馬鈴薯病毒病生物芯片檢測技術步驟

2.1 樣品的制備

取待檢測脫毒苗莖段、薯塊（取上部試管苗0.3 g或切取靠近塊莖臍部1 cm×1 cm，厚3 mm大小的表皮）樣品分別標記后，加入細胞裂解液Rapid EB I 500 ？滋L研磨，快速離心30 min吸取上清液100 ？滋L，初樣品在PCR儀器中加熱99 ℃/85 ℃ 15 min，6 000 r/min離心30 s，吸取上清液 25 ？滋L，加入Rapid EB II 475 ？滋L即為檢測樣品，備用。

2.2 一步驟核酸反轉錄與生物芯片雜合反應

向0.5 mL eppendorf管中加入檢測樣品2 ？滋L、RT-PCR混合試劑（PV-III MIX）10 ？滋L、Taq 0.3 ？滋L、RT 0.2 ？滋L，PCR擴增（擴增程序45 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min、進入循環后依94 ℃ 15 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s進行30次循環，72 ℃ 7 min、溫度8 ℃），PCR擴增結束后95 ℃ 3.5 min斷鏈，進入雜合反應階段：吸取擴增樣品5 ？滋L加入到生物芯片板中，加HA buffer 50 ？滋L密封，在55 ℃、1 000 r/min條件下進行雜合反應，40 min后加200 ？滋L Wash buffer清洗液清洗兩邊，之后每孔快速加100 ？滋L混合液（Ster-Ap 酶底物∶B buffer 阻斷液=0.1∶100.0）55 ℃靜置20 min阻斷雜合反應，繼續加入200 ？滋L Wash buffer 清洗液清洗兩邊，每孔加入100 ？滋L（NBT/BCIP 呈色劑∶C buffer 呈色液=1∶100）混合液顯色，避光7 min。自來水沖洗，直接觀察結果。

2.3 結果讀取

生物芯片檢測的結果分為失效、陽性、陰性。失效：質控位點（C3或A1、A5、E1、E5）不顯色，說明PCR反應和雜合反應已失效；陰性：質控位點（C3和A1、A5、E1、E5）均出現顏色較深的黑點，檢測位點（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）不顯色，說明馬鈴薯樣品無被檢測病毒；陽性：質控位點（C3和A1、A5、E1、E5）均出現顏色較深的黑點，檢測位點（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）出現顏色明顯的黑點，說明馬鈴薯樣品帶病毒。檢測穩點顏色越深，樣品中的被檢測病毒含量越高。

3 genetop馬鈴薯病毒試劑盒的優點

genetop馬鈴薯病毒試劑盒利用核酸的專一性，可直接

（下轉第106頁）

生物芯片（Biochip）是20世紀90年代中期以來形成的最具深遠意義的重大科技進展之一[1]，目前主要應用在醫學和食品等領域[2]。近年來，生物芯片檢測技術是繼酶聯免疫吸附、免疫膠體金技術（ICG）和反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）方法應用之后，又一種利用核酸專一性，檢測速度快、靈敏度高、專一性強、操作簡便、結果易讀取的新型病毒檢測技術[3-7]。筆者就Genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測方法的原理、特點及在馬鈴薯種薯生產中的應用前景進行綜述。

1 genetop馬鈴薯病毒試劑盒檢測的基本原理

genetop馬鈴薯病毒試劑盒是由臺灣巨合生物科技股份有限公司開發的新型馬鈴薯病毒生物芯片試劑，該試劑盒針對馬鈴薯病毒病中的核酸進行分子檢測，在生物芯片孔盤表面已預先植入8種馬鈴薯病毒之專一性探針，病毒核酸萃取后經由一步核酸反轉錄聚合酶連鎖反應，將馬鈴薯病毒特有的基因片段訊號放大，與芯片盤上的探針進行專一性結合；反應結果可利用肉眼直接判讀。genetop馬鈴薯病毒試劑盒主要包括核酸萃取（Virus RNA Extraction）、一步驟核酸反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR）以及核酸雜合反應（Hybridization），同時使用生物素與堿性磷酸酶系統的化學非放射性的呈色方法進行顯色，避光染色后，結果可利用肉眼直接讀取。該方法是進行定性檢測的一種有效方法。

2 馬鈴薯病毒病生物芯片檢測技術步驟

2.1 樣品的制備

取待檢測脫毒苗莖段、薯塊（取上部試管苗0.3 g或切取靠近塊莖臍部1 cm×1 cm，厚3 mm大小的表皮）樣品分別標記后，加入細胞裂解液Rapid EB I 500 ？滋L研磨，快速離心30 min吸取上清液100 ？滋L，初樣品在PCR儀器中加熱99 ℃/85 ℃ 15 min，6 000 r/min離心30 s，吸取上清液 25 ？滋L，加入Rapid EB II 475 ？滋L即為檢測樣品，備用。

2.2 一步驟核酸反轉錄與生物芯片雜合反應

向0.5 mL eppendorf管中加入檢測樣品2 ？滋L、RT-PCR混合試劑（PV-III MIX）10 ？滋L、Taq 0.3 ？滋L、RT 0.2 ？滋L，PCR擴增（擴增程序45 ℃ 30 min、94 ℃ 2 min、進入循環后依94 ℃ 15 s、58 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s進行30次循環，72 ℃ 7 min、溫度8 ℃），PCR擴增結束后95 ℃ 3.5 min斷鏈，進入雜合反應階段：吸取擴增樣品5 ？滋L加入到生物芯片板中，加HA buffer 50 ？滋L密封，在55 ℃、1 000 r/min條件下進行雜合反應，40 min后加200 ？滋L Wash buffer清洗液清洗兩邊，之后每孔快速加100 ？滋L混合液（Ster-Ap 酶底物∶B buffer 阻斷液=0.1∶100.0）55 ℃靜置20 min阻斷雜合反應，繼續加入200 ？滋L Wash buffer 清洗液清洗兩邊，每孔加入100 ？滋L（NBT/BCIP 呈色劑∶C buffer 呈色液=1∶100）混合液顯色，避光7 min。自來水沖洗，直接觀察結果。

2.3 結果讀取

生物芯片檢測的結果分為失效、陽性、陰性。失效：質控位點（C3或A1、A5、E1、E5）不顯色，說明PCR反應和雜合反應已失效；陰性：質控位點（C3和A1、A5、E1、E5）均出現顏色較深的黑點，檢測位點（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）不顯色，說明馬鈴薯樣品無被檢測病毒；陽性：質控位點（C3和A1、A5、E1、E5）均出現顏色較深的黑點，檢測位點（A3、B1、B3、B5、D1、D3、C1、E3、D5）出現顏色明顯的黑點，說明馬鈴薯樣品帶病毒。檢測穩點顏色越深，樣品中的被檢測病毒含量越高。

3 genetop馬鈴薯病毒試劑盒的優點

genetop馬鈴薯病毒試劑盒利用核酸的專一性，可直接檢測葉片、組培苗和種薯塊莖中是否攜帶病毒，有效解決了ELISA只檢測葉片或薯塊，不能檢測類病毒的問題，以生物芯片檢測為技術核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒比傳統RT-PCR檢測具有以幾個方面的優點：時間短、準確度和靈敏度高，擴充性與多重檢測效果好，所用試劑無毒害、檢測結果肉眼可判讀，操作簡便，易于推廣。genetop馬鈴薯病毒試劑盒量化檢測時，平均價格低于ELISA，該試劑盒的推廣有助于馬鈴薯種薯病毒檢測的效率和質量提升，操作步驟簡單，易在基層種薯監控單位和種薯繁育企業推廣。

4 genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯種薯質量控制體系中的應用前景

我國馬鈴薯種植面積54.32萬hm2，面積位居世界首位，產量水平較低（15 818 kg/hm2），是發達國家產量水平的1/3～1/2，我國馬鈴薯產量遠低于世界平均水平（2012年FAO數據）。影響我國馬鈴薯產量的主要因素是病毒病危害，研究證明馬鈴薯病毒引起馬鈴薯減產10%～30%，如果不同病害混合侵染，可以造成50%～80%以上的產量損失[8]。利用莖尖分生組織培養技術獲得脫毒復壯種薯，可從根本上解決這一問題，種薯的質量是影響馬鈴薯產量的重要因素。目前，我國大面積推廣應用的DAS-ELISA檢測技術只能檢測試管苗或植株，不能對原原種、原種和一級種薯塊莖進行直接快速檢測[3]。特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本低的病毒檢測技術的缺乏是是限制馬鈴薯種薯市場瓶頸。以生物芯片檢測為技術核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒有效解決了ELISA漏檢的問題，達到了檢測葉片、組培苗或薯塊，一個反應具有可同時檢測多種病毒、檢測時間短、操作簡便、易于推廣等特點。目前，馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術在馬鈴薯種薯質量控制體系中的應用剛剛起步，該產品在歐洲市場已進入試用階段。該技術現已得到國內外學者的高度重視，因此馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術在馬鈴薯種薯生產和質量控制體系中具有巨大的發展潛力和應用前景。

5 參考文獻

[1] 谷宇.馬鈴薯病毒與類病毒檢測芯片的制備及應用[D].南京：東南大學，2004.

[2] 吳明煜，郭曉紅，王萬賢，等.生物芯片研究現狀及應用前景[J].科學技術與工程，2005（7）：421-430.

[3] 楊小琴，張艷艷，張媛媛，等.馬鈴薯病毒檢測技術研究進展[J].現代農業科技，2014（24）：148-149.

[4] SHENA M，SHALON D，DAVIS R W，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray[J].Scie-nce，1995，270：464-470.

[5] HADIDI A，CZOSNEK H，BARBA M.DNA microarrays and their poten-tial applications for the detection of plant viruses，viroids，and phytopl-asmas[J].Plant Pathol，2004，86：97-104.

[6] BYSTRICKA D，LENZ 0，MIAZ I，et al.DNA microarray：parallel detect-ion of potato viruses[J].Acta Virol，2003，47：41-44.

[7] BOONHAM N，WALSH K，SMITH P，et al.Detection of potato viruses u-sing microarray technology：towards a generic method for plant viral disease diagnosis[J].Viral Methods，2003，108：181-187.

[8] 李子芳.中國馬鈴薯主要病害圖鑒[M].北京：中國農業出版社，2004.（上接第104頁）

檢測葉片、組培苗和種薯塊莖中是否攜帶病毒，有效解決了ELISA只檢測葉片或薯塊，不能檢測類病毒的問題，以生物芯片檢測為技術核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒比傳統RT-PCR檢測具有以幾個方面的優點：時間短、準確度和靈敏度高，擴充性與多重檢測效果好，所用試劑無毒害、檢測結果肉眼可判讀，操作簡便，易于推廣。genetop馬鈴薯病毒試劑盒量化檢測時，平均價格低于ELISA，該試劑盒的推廣有助于馬鈴薯種薯病毒檢測的效率和質量提升，操作步驟簡單，易在基層種薯監控單位和種薯繁育企業推廣。

4 genetop馬鈴薯病毒試劑盒在馬鈴薯種薯質量控制體系中的應用前景

我國馬鈴薯種植面積54.32萬hm2，面積位居世界首位，產量水平較低（15 818 kg/hm2），是發達國家產量水平的1/3～1/2，我國馬鈴薯產量遠低于世界平均水平（2012年FAO數據）。影響我國馬鈴薯產量的主要因素是病毒病危害，研究證明馬鈴薯病毒引起馬鈴薯減產10%～30%，如果不同病害混合侵染，可以造成50%～80%以上的產量損失[8]。利用莖尖分生組織培養技術獲得脫毒復壯種薯，可從根本上解決這一問題，種薯的質量是影響馬鈴薯產量的重要因素。目前，我國大面積推廣應用的DAS-ELISA檢測技術只能檢測試管苗或植株，不能對原原種、原種和一級種薯塊莖進行直接快速檢測[3]。特異性強、靈敏度高、操作簡便、成本低的病毒檢測技術的缺乏是是限制馬鈴薯種薯市場瓶頸。以生物芯片檢測為技術核心的genetop馬鈴薯病毒試劑盒有效解決了ELISA漏檢的問題，達到了檢測葉片、組培苗或薯塊，一個反應具有可同時檢測多種病毒、檢測時間短、操作簡便、易于推廣等特點。目前，馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術在馬鈴薯種薯質量控制體系中的應用剛剛起步，該產品在歐洲市場已進入試用階段。該技術現已得到國內外學者的高度重視，因此馬鈴薯病毒生物芯片檢測技術在馬鈴薯種薯生產和質量控制體系中具有巨大的發展潛力和應用前景。

5 參考文獻

[1] 谷宇.馬鈴薯病毒與類病毒檢測芯片的制備及應用[D].南京：東南大學，2004.

[2] 吳明煜，郭曉紅，王萬賢，等.生物芯片研究現狀及應用前景[J].科學技術與工程，2005（7）：421-430.

[3] 楊小琴，張艷艷，張媛媛，等.馬鈴薯病毒檢測技術研究進展[J].現代農業科技，2014（24）：148-149.

[4] SHENA M，SHALON D，DAVIS R W，et al.Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNAmicroarray[J].Scie-nce，1995，270：464-470.

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[6] BYSTRICKA D，LENZ 0，MIAZ I，et al.DNA microarray：parallel detect-ion of potato viruses[J].Acta Virol，2003，47：41-44.

[7] BOONHAM N，WALSH K，SMITH P，et al.Detection of potato viruses u-sing microarray technology：towards a generic method for plant viral disease diagnosis[J].Viral Methods，2003，108：181-187.

[8] 李子芳.中國馬鈴薯主要病害圖鑒[M].北京：中國農業出版社，2004.