Jagged1/Notch3信號通路蛋白在人三陰乳腺癌中的表達及臨床意義*

王曉珊， 李芳華， 張 曉， 曹 丹， 羅 鋒

(1.四川省人民醫(yī)院腫瘤中心， 成都 610072； 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤中心, 成都 610041)

Jagged1/Notch3信號通路蛋白在人三陰乳腺癌中的表達及臨床意義*

王曉珊1， 李芳華1， 張 曉1， 曹 丹1， 羅 鋒2△

(1.四川省人民醫(yī)院腫瘤中心， 成都 610072； 2.四川大學(xué)華西醫(yī)院腫瘤中心, 成都 610041)

目的： 研究Jagged1/Notch3在TNBC患者中的表達水平及臨床意義，探討Jagged1和Notch3異常表達對TNBC患者的預(yù)后影響。方法： Ventana免疫組化法檢測Jagged1、Notch3在石蠟標(biāo)本的蛋白表達，分析其與臨床病理及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。結(jié)果： Jagged1和Notch3在TNBC組織中的陽性表達率分別為35.7%(25/70)和40.0%(28/70)。Jagged1在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達高，Notch3則在4個以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ期患者中的表達更高。結(jié)論： TNBC患者中Jagged1/Notch3蛋白的異常表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期相關(guān)。

Jagged1； Notch3； 預(yù)后； 三陰乳腺癌

乳腺癌是目前全球女性發(fā)病率高居第一位的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)乳腺癌病例超過一百萬，歐美發(fā)達國家平均不到十名女性就有一名患乳腺癌。中國是目前乳腺癌發(fā)病率增長最快的國家之一，且中國婦女發(fā)病年齡更加年輕，是目前的重大疾病負擔(dān)[1]。應(yīng)用內(nèi)分泌治療以及曲妥珠單抗靶向治療對激素受體陽性和Her2(+)乳腺癌患者的治療有效率有了明顯提高[2]。但是分子亞型三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)因為缺乏雌激素受體(estrogen receptor,ER)和孕激素受體(progesterone receptor,PR)表達，并且無人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor 2,Her2)基因擴增表達，對激素內(nèi)分泌治療和針對Her2(+)的靶向治療都不敏感，預(yù)后差[3]。因此對于這一難治性乳腺癌亞型急需有意義的靶點和治療方法改善治療效果和延長生存[4-5]。Jagged1/Notch3是目前Notch信號通路研究的熱點，其在TNBC的作用及預(yù)后的關(guān)系目前還不清楚，亟待解決與闡明。因此我們研究了Jagged1/Notch3蛋白水平的表達情況及與臨床病理因素的相關(guān)性，期望初步揭示Jagged1/Notch3在TNBC中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般臨床資料

收集四川省人民醫(yī)院2005年3月到2012年12月臨床病理資料完整的乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本70例，病例均經(jīng)過免疫組化染色(IHC)或原位熒光檢測(FISH)確認為三陰乳腺癌。標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋及常規(guī)HE染色。所有病例由兩名高年資病理醫(yī)師復(fù)核病理診斷，選取腫瘤組織豐富的蠟塊用于后續(xù)Ventana免疫組化檢測。

1.2 主要試劑

采用全自動多功能組織病理檢測系統(tǒng)(Benchmark XT)進行免疫組織化學(xué)Jagged1、Notch3的染色。兔抗人Notch3多克隆抗體(購自英國Abcam公司,產(chǎn)品編號為ab23426)工作濃度為1 ∶500；兔抗人Jagged1單克隆抗體(購自美國EPITOMICS公司, 產(chǎn)品編號為3772- 1)工作濃度為1 ∶250；全自動多功能組織病理檢測系統(tǒng)Benchmark XT試劑盒(購自羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司)；非生物素標(biāo)記EnVisionTM System,HRP,鼠/兔(購自丹麥Dako公司，產(chǎn)品編號為20003627)；DAB(購自丹麥Dako公司，產(chǎn)品編號為00092783)。

1.3 免疫組化染色

由儀器全程操作，步驟嚴格按照說明書進行，已知強陽性表達的組織作為陽性對照，Notch3陽性對照為乳腺癌組織，Jagged1陽性對照為膀胱癌組織。以PBS代替一抗做陰性對照。Notch3結(jié)果依據(jù)Hajime[6]已報道標(biāo)準進行判讀，Notch3定位在細胞膜和細胞核。具體為：在低倍鏡下(×100)觀察乳腺正常上皮和對應(yīng)的癌灶組織，在中倍鏡下(×200)對強度表達明顯的地區(qū)進行染色強度評價。陽性細胞率<5%或未檢測到為0分；陽性細胞率為5%～50%為1+；陽性細胞率≥50%但小于3+表達為2+，強度高于正常上皮兩倍表達為3+；0～2+為陰性表達(-) ，3+為陽性表達(+)。Jagged1結(jié)果依據(jù)Dickson已報道Allred評分標(biāo)準進行判讀[7]，Jagged1定位在細胞膜，具體為：免疫組化染色陽性為黃色或棕黃色顆粒，在低倍鏡下(×100)和中倍鏡下(×200)依據(jù)腫瘤細胞染色強度和著色細胞占總腫瘤細胞的比例進行分級評分。染色強度：無著色記0分，弱著色或淡黃色記1分，中間色記2分，強棕黃色記3分。著色細胞數(shù)比例評分：每張切片光鏡隨機觀察5個中倍鏡視野(×200)，每個視野計數(shù)100個細胞，計算染色細胞占腫瘤細胞平均百分比作為該切片陽性細胞百分比。無細胞著色記0分，著色細胞< 1%記1分，著色細胞1%～10%記2分， 11%～33%記3分，34%～65%記4分，≥66%記5分。兩者計分之和<4分為陰性表達(-)， ≥4分為陽性表達(+)。

1.4 臨床治療及隨訪

按2009年第七版美國癌癥研究聯(lián)合會(AJCC)TNM分期進行病理分期，2003年WHO《乳腺及女性生殖器官腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》標(biāo)準進行病理分型、分級。根據(jù)ECOG標(biāo)準體力狀態(tài)評分為0～1分，術(shù)前均未接受過放療、化療、內(nèi)分泌治療及生物靶向治療，術(shù)中根據(jù)手術(shù)情況，術(shù)后根據(jù)NCCN指南推薦及患者風(fēng)險評估制定術(shù)后輔助治療方案。患者在術(shù)后及術(shù)后輔助治療中均進行了規(guī)律隨訪，為術(shù)后前兩年每3個月1次，術(shù)后三年到五年每6個月1次，五年后每年1次。隨訪內(nèi)容包括查體，血常規(guī)、生化及腫瘤標(biāo)志物等血液學(xué)檢查，每年1次的胸部CT檢查，乳腺和腹部B超檢查，而骨掃描、骨密度、鉬靶攝片及核磁共振則根據(jù)情況選擇進行。復(fù)習(xí)所有患者的病歷資料，記錄每例患者的臨床病理特征以及隨訪資料。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，研究數(shù)據(jù)均以平均值(Mean)±標(biāo)準偏差(SD)表示。蛋白表達量比較采用方差分析ANOVA檢驗，兩兩比較采用配對Student’s-t檢驗；比較研究因素在三陰乳腺癌不同臨床及病理特征的差別采用χ2檢驗；所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析均以P<0.05為檢驗標(biāo)準。

2 結(jié) 果

2.1 臨床病理特征

70例三陰乳腺癌患者全部為女性，中位年齡50歲(27～87歲)，其中38例患者已絕經(jīng)。所有病例均接受改良根治術(shù)或保乳術(shù)，術(shù)后標(biāo)本經(jīng)常規(guī)HE及免疫組化檢查，依據(jù)2012年WHO《乳腺及女性生殖器官腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)》標(biāo)準證實為三陰乳腺癌，原發(fā)腫瘤≤2cm的21例(30%)，>2cm的49例(70%)；包括65例(92.9%)浸潤性導(dǎo)管癌3例(4.3%)化生性癌，2例(2.9%)髓樣癌；其中高分化5例(7.1%)，中分化32例(45.7%)，低分化33例(47.1%)。根據(jù)術(shù)后病檢結(jié)果，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移12例(17.1%)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例(82.9%)；依據(jù)第六版美國癌癥研究聯(lián)合會(AJCC)TNM分期，Ⅰ期11例(15.7%)，Ⅱ期43例(61.4%)，Ⅲ期16例(22.9%)。術(shù)后63例(90%)患者接受了包含紫杉醇或蒽環(huán)類藥物為基礎(chǔ)的輔助化療。最后一次隨訪截止為2015年12月。在隨訪期間9例(12.9%)患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)；24例(34.3%)患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其中單純骨轉(zhuǎn)移4例(5.7%)，單純肺轉(zhuǎn)移5例(7.1%)，單純腦轉(zhuǎn)移5例(7.1%)，單純肝轉(zhuǎn)移1例(1.4%)，肺、骨轉(zhuǎn)移5例(7.1%)，腦、骨轉(zhuǎn)移3例(4.3%)，肺肝轉(zhuǎn)移1例(1.4%)。

2.2 Jagged1的表達

Jagged1主要表達于細胞膜，陽性染色呈棕黃色細顆粒狀。癌巢腫瘤細胞的著色強，間質(zhì)和正常乳腺組織不表達。Jagged1在三陰乳腺癌組織中的陽性表達率為35.7%(25/70)。(見圖1)

圖1 Jagged1蛋白在TNBC癌組織的不同表達(Ventana IHC)

Jagged1的表達分別在三陰乳腺癌患者不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、原發(fā)腫瘤大小、組織類型、分化程度、脈管癌栓、分期組別之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但在不同的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組別之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(表1)。無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者較有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的Jagged1表達高。

2.3 Notch3的表達

Notch3主要表達于細胞膜和細胞核，陽性染色呈棕黃色細顆粒狀。癌巢腫瘤細胞的著色強，間質(zhì)血管內(nèi)皮偶有非特異著色。Notch3在三陰乳腺癌組織中的陽性表達率為40.0%(28/70)。(見圖2)

圖2 Notch3蛋白在TNBC癌組織的不同表達(Ventana IHC)

Notch3的表達分別在三陰乳腺癌患者不同年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、原發(fā)腫瘤大小、組織類型、分化程度、脈管癌栓的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但在不同的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.017)、不同分期(P=0.027)之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。4個以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期Ⅲ期患者的Notch3表達更高。

表1 TNBC中Jagged1/Notch3的表達與臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

乳腺癌是一種異質(zhì)性疾病，具有不同的組織病理特點及不同的臨床結(jié)果。根據(jù)ER/PR/HER2的表達，將乳腺癌分類為luminal A (ER+orPR+/HER2-),luminal B (ER+orPR+/HER2+)，HER2(ER-/PR-/HER2+)，TNBC(ER-/PR-/HER2-)。TNBC又進一步亞分類為基底型乳腺癌BLBC(ER-/PR-/HER2-/CK5/6+orEGFR+)及五陰乳腺癌QNBC (ER-/PR-/HER2-/CK5/6-/EGFR-)。三陰乳腺癌占到了所有乳腺癌的15%～25%,相比其他亞型預(yù)后更差，總生存和無復(fù)發(fā)生存期更短，同時存在侵襲性的基因表型如高分級低分化，大范圍的壞死和高分裂指數(shù)，容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，更好發(fā)于年輕人群[8]。本研究中，我們使用了全自動的Ventana免疫組化平臺分析Jagged1和Notch3的表達，該檢測具有非常好的可重復(fù)性及一致性[4]。Ventana全自動免疫組化平臺在ALK檢測中據(jù)報道有100%的敏感性和98%的特異性，與FISH檢測有較高的一致性[9-10]。

本研究結(jié)果顯示：Jagged1和Notch3在TNBC組織中的陽性表達率分別為35.7%(25/70)和40.0%(28/70)。相關(guān)研究顯示Notch信號通路在很多惡性腫瘤中表達失調(diào)，其配體及受體在宮頸癌、結(jié)腸癌、頭頸癌、肺癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、急性白血病、腦膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、卵巢癌、前列腺癌及乳腺癌中過表達[11-16]。本研究臨床病理分析提示，Jagged1在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達高，Notch3則在4個以上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和Ⅲ期患者中的表達更高。Jagged1/Notch3在其他實體瘤中的表達也與臨床病理特征相關(guān)。Jagged1作為Notch3的主要配體也在卵巢癌中高表達，Jagged1/Notch3的相互作用形成近分泌環(huán)路從而促進卵巢癌的增殖[17]。卵巢癌中Jagged1表達正反饋調(diào)節(jié)Notch3信號通路[18]，Notch3過表達與卵巢癌更晚分期相關(guān)[19-20]。Jagged1高表達的頭頸鱗狀細胞癌新生血管形成能力增強，腫瘤生長加快，并且Jagged1的表達水平與腫瘤血管形成和腫瘤生長密切相關(guān)[21]。相關(guān)的研究顯示726名淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者進行原位雜交和免疫組化組織微陣列研究中Jagged1的mRNA過表達與基底細胞型乳腺癌標(biāo)志物相關(guān)(P=0.0077)，將近2/3的基底細胞型乳腺癌患者高表達Jagged1mRNA。Jagged1陽性表達的患者腫瘤更大，ER與PR陰性，分化低，更容易發(fā)生脈管癌栓，與淋巴結(jié)陰性轉(zhuǎn)移的復(fù)發(fā)相關(guān)[22]。我們的研究中也顯示Jagged1在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達高。對62例中國乳腺癌患者標(biāo)本分析顯示，Notch1和Notch3的RNA水平似乎與Her2表達相關(guān)，高Notch3表達的患者有更低的ER陽性、PR陽性表達率，Notch3在低Notch1表達的乳腺癌患者中表達更為常見，但未顯示出統(tǒng)計學(xué)差異[23]。Notch信號通路在TNBC增殖、生長、侵襲中起重要作用并存在不同程度的激活[24]，與三陰乳腺癌密切相關(guān)。對Notch通路的靶向抑制，可能是對TNBC治療有意義的靶點。Sansone[25]等最近在乳腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)Jagged1依賴的Notch3信號通路的激活可調(diào)節(jié)其干細胞特性，Notch3不僅在三陰乳腺癌細胞系中擴增表達[26]，還可在體外標(biāo)記克隆源性乳腺導(dǎo)管前體細胞并調(diào)控細胞增殖，并在病理狀態(tài)下促進癌細胞生存從而保護其免受藥物的靶向攻擊[27]。

本研究初步分析了Jagged1/Notch3在TNBC患者中的表達水平及臨床意義，探討了Jagged1和Notch3異常表達對TNBC患者的預(yù)后影響了解其在乳腺癌亞型如三陰乳腺癌分子機制中的作用，以便更好的預(yù)測預(yù)后及制定治療策略，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。本研究的不足之處在于組織樣本量還可擴大以進一步明確差異， Jagged1/Notch3對三陰乳腺癌長期預(yù)后的影響還不清楚。希望在后續(xù)的臨床工作中繼續(xù)深入研究。

作者聲明：本文第一作者對于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任。

利益沖突：本文全部作者均認同文章無相關(guān)利益沖突；

學(xué)術(shù)不端：本文在初審、返修及出版前均通過中國知網(wǎng)(CNKI)科技期刊學(xué)術(shù)不端文獻檢測系統(tǒng)學(xué)術(shù)不端檢測；

同行評議：經(jīng)同行專家雙盲外審，達到刊發(fā)要求。

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Expression and Significance of Jagged1/Notch3 Signaling Pathway Proteins in Human Triple Negative Breast Cancer*

Wang Xiaoshan, Li Fanghua, Zhang Xiao， et al

(CancerCenter,AcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu610072,Sichuan,China)

Objective: To study the expression and clinical significance of Jagged1/Notch3 in Triple-negative breast cancer, and to clarify abnormal expression of Jagged1 and Notch3 protein for prognosis of TNBC patients. Methods： Protein expression of Jagged1 and Notch3 in paraffin wax fixed specimens were detected by Ventana Immunohistochemistry, and the relationships with clinical pathologic significance, recurrence and metastasis were analyzed. Results: A total of 70 patients were enrolled, protein expression of Jagged1 and Notch3 from paraffin specimens were detected by Ventana IHC. Positive rate of Jagged1 and Notch3 in cancer tissues were 35.7%(25/70)and 40.0%(28/70)respectively. Jagged1 expression was higher in patients with no lymph node metastasis. Notch3 expression was higher in patients with more than 4 lymph nodes metastasis and stage Ⅲ. Protein expression of Jagged1 was related to recurrence and metastasis (P=0.035), the expression of Notch3 was related to bone metastasis (P=0.038). Conclusion: It is suggested that positive expressions of Jagged1/Notch3 proteins were related with poor prognosis of TNBC patients.

Jagged1; Notch3; Prognosis; Triple-negative Breast Cancer

2016- 11- 14

2017- 01- 10

*四川省人民醫(yī)院青年基金(30305030605)

王曉珊(1982-)，女，四川人，副主任醫(yī)師，主要從事腫瘤治療工作。

△羅 鋒，男(漢族)，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：luofeng@medmail.com.cn

R737.9

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2017.01.005

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