谷氨酸轉運體和γ-氨基丁酸轉運體在腦缺血模型中的表達意義

任 力, 邢 進, 魏子龍, 王之涵, 趙 亮,邱永明, 林盈盈

(1. 上海市浦東醫院 神經外科, 上海, 201399;2. 上海交通大學附屬仁濟醫院 神經外科, 上海, 200127)

谷氨酸轉運體和γ-氨基丁酸轉運體在腦缺血模型中的表達意義

任 力1, 邢 進1, 魏子龍1, 王之涵1, 趙 亮1,邱永明2, 林盈盈2

(1. 上海市浦東醫院 神經外科, 上海, 201399;2. 上海交通大學附屬仁濟醫院 神經外科, 上海, 200127)

目的 探討谷氨酸轉運體和γ-氨基丁酸轉運體在腦缺血模型中的表達意義。方法 在體內缺血、體外缺氧2種模型中利用免疫熒光、Westen-blot、RT-PCR等技術定性定量的檢測主要的谷氨酸轉運體-1(EAAC-1)和γ-氨基丁酸轉運體-1(GAT-1)的表達情況。結果 在局灶性腦缺血模型(大鼠腦中動脈缺血模型)和缺氧條件下培養的原代神經元中均發現, EAAC1表達下降, GAT1表達上升。結論 在腦缺血缺氧狀態下EAAC1表達下降, GAT1表達上調。

腦缺血; 缺氧; 谷氨酸轉運體1; γ-氨基丁酸轉運體1

缺血缺氧是導致癲癇、中風等神經生理疾病發生的主要原因之一，具有較高致死率、致殘率[1]。L-谷氨酸因腦缺血缺氧過度釋放，導致中樞神經系統神經元死亡[2]。同時, γ-氨基丁酸(GABA)受體活化以抑制L-谷氨酸過度釋放[3]。GABA轉運體與谷氨酸轉運體協同作用，共同維持細胞外GABA和谷氨酸的含量，參與正常神經元活動及大腦的多種病理狀態[4]。目前，關于這兩種氨基酸轉運體在腦缺血性疾病中的具體表達尚不明確。本研究通過建立大鼠腦中動脈缺血(MCAO)模型，探討谷氨酸轉運體-1(EAAC-1)及γ-氨基丁酸轉運體-1(GAT-1)在體內外缺血缺氧條件下的表達情況。

1 材料與方法

1.1 大鼠MCAO模型的建立

健康成年雄性SD大鼠16只，體質量250～300 g, 由上海交通大學醫學院動物實驗中心提供，食物和水隨意提供，設置12、12 h日夜周期。本研究采用的動物實驗研究通過動物實驗倫理委員會的批準，并依據上海交通大學醫學院的動物實驗指南進行。

SD大鼠隨機分為對照組(手術但無栓塞)與觀察組，每組8只。觀察組腦缺血24 h后腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，按照文獻[4]對大鼠進行再灌注。具體操作如下: 1根單絲尼龍線與熱處理后的圓尖通過頸外動脈引入右頸內動脈，直到到達一個輕微的阻力處，維持90 min后撤回，以便再灌注。再灌注開始的特定時間，采用戊巴比妥鈉腹腔注射100 mg/kg將動物深度麻醉。大鼠心臟灌流4 ℃生理鹽水后，在冰上解剖獲取相應的缺血中心區和半暗帶區腦組織，用于組織mRNA和蛋白的分析。大鼠心臟灌注4 ℃生理鹽水后, 4%多聚甲醛(pH=7.4)灌流固定腦組織。取腦組織, 4% PFA固定，低溫保存于20%、30%蔗糖溶液中。在-1.80和-4.80 mm間的前囟水平行連續冠狀切片，共收集24個切片進行染色。

1.2 細胞培養

原代神經元在含有10% FBS(PAA，Linz，Austria)DMEM中培養，置于5% CO2、37℃的細胞培養箱中。為模擬體內缺氧環境，將細胞接種于10 cm培養皿中，用CoCl2處理培養的神經元24、48 h后，采用免疫印跡法和RT-PCR法觀察EAAC1和GAT1的表達情況。

1.3 免疫熒光

采用4%多聚甲醛于4 ℃下固定含有細胞的玻片15 min, 并使用含有0.1%皂素、1%羊血清或2%驢血清的PBS溶液室溫下孵育30 min。加入相應的小鼠EAAC1、GAT1一抗，稀釋500倍, 4 ℃孵育過夜。吸去一抗，洗滌玻片，使用Alexa-Fluor-488標記的山羊抗兔熒光二抗，室溫避光孵育2 h。激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4 實時熒光定量PCR

Trizol法抽提RNA, 并用DNA酶去除樣本中的DNA。使用RNA反轉錄試劑盒合成cDNA, GAPDH作為引物內參。實時熒光定量PCR使用 SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，重復3次，采用7900HT快速實時PCR機進行分析。

1.5 免疫印跡分析法

使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸化抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白。吸取適量蛋白上樣至10%～15%聚丙烯酰胺凝膠，轉膜至硝酸纖維素膜。一抗孵育過夜，適當濃度的二抗孵育1 h。添加ECL化學發光顯影液，使用柯達膠片曝光。一抗為EAAC1、GAT1, Actin為蛋白內參。

2 結 果

2.1 EAAC1、GAT1在大鼠MCAO再灌注模型半暗帶區的表達

采用免疫熒光法觀察EAAC1、GAT1在半暗帶區的表達，結果顯示，觀察組再灌注24 h后, EAAC1蛋白表達相比于對照組明顯減少, GAT1蛋白表達相比于對照組增加。見圖1。

圖1 大鼠腦中動脈缺血再灌注模型中EAAC1和GAT1表達

2.2 EAAC1、GAT1在缺氧刺激下的神經元中的表達

CoCl2處理24、48 h后，神經元EAAC1蛋白表達下調，并呈時間依賴性(圖2A), GAT1蛋白表達上調(圖2B); RT-PCR法檢測EAAC1和GAT1的mRNA水平, CoCl2處理24、48 h后, EAAC1 mRNA水平下調(圖2C), GAT1 mRNA水平上調(圖2D)。見圖2。

圖2 EAAC1和 GAT1在缺氧誘導的神經元中的表達

3 討 論

腦缺血再灌注損傷由多因素共同作用所致，其中興奮性氨基酸毒性、梗死周圍去極化、炎癥和凋亡是引起神經元死亡的主要病理生理機制，構成了腦缺血再灌注損傷的級聯反應[5-6]。谷氨酸為興奮性神經遞質，具有神經毒性作用。GABA為抑制性神經遞質，具有神經保護作用。GABA轉運體和谷氨酸轉運體是中樞神經系統重要的轉運蛋白，參與大腦多種病理狀態，尤其是腦缺血性疾病和癲癇[7-8]。谷氨酸轉運體家族含5個成員，分別是GLAST/EAAT1、GLT-1/EAAT2、EAAC1/EAAT3、EAAT4和EAAT5[9]。研究[10-11]證明，消除GLT-1的小鼠發生嚴重癲癇，可見GLT-1在中樞神經系統中發揮重要作用。與GLT-1相比，EAAC1在神經元死亡中的作用尚未明確。除了介導細胞外谷氨酸轉運，最新研究[12]發現EAAC1可作為半胱氨酸轉運體從而發揮作用，并維持神經元的谷胱甘肽代謝。因此，推測EAAC1可能在維持谷氨酸轉運外，還發揮著其他重要的作用。鈉-氯離子依賴性GAT1主要負責將GABA從神經傳遞的突觸間隙去除，從而終止了GABA神經傳遞的作用[13]。

本研究中, EAAC1在局灶性腦缺血MCAO模型及缺氧條件下培養的原代神經元中的表達均降低, GAT-1的表達輕度升高，與國內研究[14]結果一致。可見腦缺血再灌注后谷氨酸的神經毒性及GABA的神經保護作用, EAAC-1可通過調節谷氨酸水平保護神經元損傷。本研究還發現, CoCl2處理后，大量的神經元凋亡，可見缺氧和能量不足所致的細胞凋亡是腦缺血缺氧損傷的重要發病機制。

[1] Roger V L, Go A S, Lloyd-Jones D M, et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2011 Update：A Report From the American Heart Association[J]. Circulation, 2010, 123(4): e18-e209.

[2] Kostandy B B. The role of glutamate in neuronal ischemic injury: the role of spark in fire[J]. Neurol Sci, 2012, 33(2): 223-237.

[3] Hutchinson P J, O′Connell M T, Al-Rawi P G, et al. Increases in GABA concentrations during cerebral ischaemia: a microdialysis study of extracellular amino acids[J]. J Neurol Neurosurg Psychiatr, 2002, 72(1): 99-105.

[4] 毛小元, 蔡際群. γ-氨基丁酸轉運體與癲癇關系的研究進展[J]. 國際神經病學神經外科學雜志, 2009, 36(3): 261-264.

[5] 楊娟. 谷氨酸轉運體與癲癇關系的研究進展[J]. 中風與神經疾病雜志, 2012, 29(4): 377-379.

[6] Jiang J, Amara S G. New views of glutamate transporter structure and function: advances and challenges[J]. Neuropharmacology, 2011, 60(1): 172-181.

[7] Watanabe T, Morimoto K, Hirao T, et al. Amygdala-kindled and pentylenetetrazole-induced seizures in glutamate transporter GLAST-deficient mice[J]. Brain Res, 1999, 845(1): 92-96.

[8] Li L, Zuo Z. Glutamate transporter type 3 knockout reduces brain tolerance to focal brain ischemia in mice[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2011, 31(5): 1283-1292.

[9] 金亦濤, 劉國卿, 唐治華. γ-氨基丁酸轉運體研究進展[J]. 國外醫學: 生理、病理科學與臨床分冊, 2004, 24(1): 8-10.

[10] Bianchi M G, Bardelli D, Chiu M, et al. Changes in the expression of the glutamate transporter EAAT3/EAAC1 in health and disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2014, 71(11): 2001-2015.

[11] 劉青青, 郭虹, 王少峽, 等. 腦缺血損傷機制的研究進展[J]. 中華中醫藥學刊, 2012, 30(6): 1228-1230.

[12] Lussier A L, Romay-Tallon R, Caruncho H J, et al. Altered GABAergic and glutamatergic activity within the rat hippocampus and amygdala in rats subjected to repeated corticosterone administration but not restraint stress[J]. Neuroscience, 2013, 231: 38-48.

[13] Smith K S, Rudolph U. Anxiety and depression: mouse genetics and pharmacological approaches to the role of GABA(A) receptor subtypes[J]. Neuropharmacology, 2012, 62(1): 54-62.

[14] 陳魁, 胡風云. 電針水溝穴對全腦缺血昏迷大鼠腦組織谷氨酸轉運體-1γ-氨基丁酸轉運體-1的影響[J]. 山西醫藥雜志: 上半月, 2013, 42(5): 501-503.

Significance of expressions of glutamate transporters and γ-aminobutyric acid transporters in rat model with cerebral ischemia

REN Li1, XING Jin1, WEI Zilong1, WANG Zhihan1, ZHAO Liang1,QIU Yongming2, LIN Yingying2

(1.DepartmentofNeurosurgery,ShanghaiPudongHospital,Shanghai, 201399; 2.DepartmentofNeurosurgery,RenjiHospitalAffiliatedtoShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai, 200127)

Objective To explore the significance of expressions of glutamate transporters and γ-aminobutyric acid transporters in the rat model with cerebral ischemia. Methods The detections of the expressions of glutamate transporter-1 (EAAC-1) and γ-aminobutyric acid transporter -1 (GAT-1) in models with ischemia in vivo and hypoxia in vitro were performed by immunofluorescence, Westen-blot and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) methods. Results The expression of EAAC1 was reduced in the cerebrum of focal cerebral ischemic MACO rat model as well as in primary neurons cultured under hypoxia. The expression of GAT1 was elevated. Conclusion EAAC1 expression decreases while GAT1 expression increases under condition of cerebral ischemia and anoxia.

cerebral ischemia; anoxia; glutamate transporter-1; γ-aminobutyric acid transporter -1

2016-11-20

上海市衛生和計劃生育委員會面上項目(201540412); 上海市衛生和計劃生育委員會中醫藥科研基金

魏子龍, E-mail: weizilong2007@163.com

R 743

A

1672-2353(2017)03-048-04

10.7619/jcmp.201703015

課題(2014JP025A); 上海市浦東新區衛生系統重點專科建設項目(PWZz2013-18)