參參康心膠囊對冠心病氣虛血瘀證小鼠Notch1和Jagged1表達的影響

金永蘭，劉喜平，張 煒，崔國寧，董俊剛，李沛清

（1.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000）

參參康心膠囊對冠心病氣虛血瘀證小鼠Notch1和Jagged1表達的影響

金永蘭1，劉喜平2*，張 煒3，崔國寧2，董俊剛2，李沛清2

（1.甘肅省人民醫院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學第一醫院，甘肅 蘭州 730000）

目的 觀察參參康心膠囊對冠心病氣虛血瘀證小鼠Notch1和Jagged1表達的影響。方法 采用游泳、高脂飼料饑餓飼養及垂體后葉素（Pituitrin；Pit）腹腔注射建立冠心病氣虛血瘀證動物模型，檢測小鼠心電圖，統計心率及T波變化，蛋白質免疫印跡法（Western blot法）檢測Notch1和Jagged1蛋白的表達，熒光定量PCR檢測Notch1和Jagged1 mRNA的表達。結果 建立的動物模型中醫證候評分符合氣虛血瘀“證”的特征，心電圖檢測符合冠心病“病”的特征。模型組Notch1蛋白及其基因表達水平明顯下降，Jagged1蛋白及其基因表達明顯升高，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；參參康心膠囊各劑量均可升高Notch1表達水平，降低Jagged1表達水平，以中劑量組最為顯著（P＜0.05）。結論 參參康心膠囊防治冠心病氣虛血瘀證的機制可能與調節Notch信號通路中Notch1受體及Jagged1配體表達水平有關，中等劑量可能是最佳劑量。

參參康心膠囊；冠心病；氣虛血瘀證；Notch1；Jagged1

參參康心膠囊源于名老中醫驗方，由水蛭等3味藥物組成，經現代制藥工藝加工而成，臨床應用多年，對冠心病、心肌梗死等心肌損傷性疾病有顯著療效。我們以往的研究表明，該制劑可減輕阿霉素（Adriamycin，ADR）心肌毒性[1]致肌損傷及防治氣虛血瘀型冠心病，其作用機理與抗氧化，清除氧自由基，調節ATP酶活性[2]減輕缺血造成的心肌線粒體水腫，阻止缺血心肌膜損傷，保護心肌超微結構[3]，升高血清6酮前列腺素F1α（6-keto-prostaglandinF1α，6-keto-PGF1α）、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）含量，降低血栓素B2（ThromboxaneB2，TXB2）、內皮素-1（Endothelin-1，ET-1）含量[4，5]有關。近年來研究發現Notch信號通路在調節心血管疾病的發生發展方面具有重要意義[6]。為了進一步揭示冠心病氣虛血瘀證的證候本質，探討參參康心膠囊防治冠心病的作用機理，本文觀察了參參康心膠囊對冠心病氣虛血瘀證小鼠Notch1和Jagged1表達的影響，以期為臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級昆明小鼠，雌雄各半，體重（30±2）g，共90只。由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（甘）2011-0001-0001163。

1.2 實驗用藥

參參康心膠囊處方藥材飲片吉林紅參、參三七、水蛭購自蘭州復興厚藥材有限責任公司，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室景明教授鑒定符合《中華人民共和國藥典》規定。以上3味藥物，取水蛭超微粉碎成細粉；其余吉林紅參、參三七兩味，加水煎煮二次，每次45 min，合并二次煎液，濾過，濾液減壓濃縮成相對密度為1.15～1.20（25℃）浸膏，噴霧干燥，收集細粉，與水蛭細粉充分混勻，干壓法制粒，裝入膠囊，即得。規格為每粒0.5 g（每粒相當于生藥1 g），實驗時用生理鹽水溶解為120 mg生藥/ml。地奧心血康膠囊（批號：1207010，成都地奧制藥集團有限公司），垂體后葉素（批號：110624，安徽宏業藥業有限公司）。

1.3 試劑及儀器

Green Master MIX熒光定量試劑盒（批號：00000740533，普洛麥格上海生物產品有限公司），EastepTM通用型總RNA提取試劑盒（批號：LS1OO，普洛麥格上海生物產品有限公司），RNAse-Exitus PLUS酶清除試劑（批號：OD008558，德國Applichem公司），PVDF蛋白轉移膜（美國Amersham Piscataway），SDS-PAGE凝膠（美國Invitro Life Tech公司），HRP山羊抗兔二抗（美國Sigma公司），Notch1及 Jagged1抗體（批號：RMA0546，蘭州維科生物工程有限公司），兔抗人GAPDH多克隆抗體及羊抗兔IgG（美國Novus公司），心電圖機（ECG6511，上海光電醫用電子儀器有限公司），超微量分光光度計（K5500，北京凱奧科技公司），超聲波破碎儀（德國merck公司），PCR熱循環儀（C1000，美國BIO RAD公司），凝膠成像分析儀（170-8170，美國BIO RAD公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥

將小鼠隨機分為空白對照組、模型組、地奧心血康組、參參康心膠囊實驗組（小劑量組、中劑量組、大劑量組），每組15只。參考文獻[7]方法，除空白對照組給予正常飲食外，其余各組均采用游泳，并給予高脂飼料饑餓（正常小鼠飲食的60%）喂養4 w。參參康心膠囊實驗組按60 kg成人常規劑量折算后作為中劑量組（3 g生藥/kg體重），高劑量組為中劑量組放大一倍（6 g生藥/kg體重），小劑量組為中劑量組縮小一倍（1.5 g生藥/kg體重）。各劑量組每天灌胃2次，空白對照組及模型組每日給予相同體積的生理鹽水，連續1 w，模型組按0.076 g/kg體重、1 ml/次灌胃。模型組及各用藥組小鼠在第一w灌胃30 min后腹腔注射Pit（劑量30 u/kg體重）[8]，空白對照組注射等體積生理鹽水。

2.2 各組小鼠中醫證候評分及心電圖檢測

方法[9]，于注射Pit15 min后對各組小鼠進行氣虛血瘀證的中醫證候評價，氣虛證的評分標準：（1）精神萎頓（3分），倦怠嗜睡（5分），對抗性、攻擊性完全消失（7分）；（2）毛發枯黃無潤澤（3分），毛發結穗打卷（5分），毛發稀疏脫落（7分）；（3）輕度稀便（3分），中度稀便（5分），重度稀便或黃綠褐色黏臭便（7分）。血瘀評分標準：（1）舌質暗淡（3分），舌質絳紫（5分）；（2）眼球由淡紅轉為深紅（3分），轉為暗紅（5分）；（3）尾尖至根部出現輕度瘀血點（3分），尾尖至根部出現中度以上瘀斑（5分）。評分結束后進行戊巴比妥鈉麻醉，取仰臥位，行心電圖檢測，觀察心率和T波高度變化，并記錄數據。

2.3 Western Blot法檢測各組小鼠心肌組織Notch1和Jagged1蛋白的表達

各組小鼠心電圖觀察后，頸椎脫臼處死，立即摘取心臟，剪取小鼠心肌組織，超聲波破碎儀粉碎組織，按每100 mg組織加1 ml預冷的蛋白提取試劑，4℃，15 000轉離心15 min，超微量分光光度計測蛋白質濃度。蛋白定量后的各組樣品等量上樣，電泳。完成后，將SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）移置于轉移電泳槽內，制備轉印蛋白夾層，將聚偏二氟乙烯膜（PVDF）置于陽極，添加適量轉移用的緩沖液，于低溫條件下將蛋白轉移至PVDF膜上，后在4℃條件下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h。去除封閉液，將轉移了蛋白的PVDF膜分別與兔源抗小鼠的Notch1及Jagged1抗體（1∶1 000）4℃孵育過夜后，以TBST清洗3次，每次5 min。再加入辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔二抗（1∶500）室溫下孵育1.5 h。以TBST漂洗4次，每次5 min，然后加Western Blot ECL顯色液。以GAPDH（1∶2 000）作為內參照，在凝膠圖像處理系統中曝光檢測，并用Quantity One 4.2軟件分析目標條帶與CAPDH光密度比值，計算相對量。

2.4 熒光定量PCR檢測小鼠心肌組織Notch1和Jagged1 mRNA的表達

取各組小鼠心肌組織，用PBS緩沖液及清水反復清洗干凈，置于1 ml離心管中，電動研磨棒進行研磨，取30～50 mmg，按照試劑盒使用說明配成20 ml的RT反應體系，將配好的體系放到PCR擴增化設置25℃5 min，42℃60 min，70℃15 min進行cDNA逆轉錄合成反應。引物采用 Primer premier 5及Oligo 6生物軟件設計，Notch1的上游序列為AATGGAGGGAG GTGCGAAGT，下游序列為TGCTGAGGCAAGGATTGGA；Jagged1的上游序列為TACCCCAGCCAGTGTCAACA，下游序列為TCTTGCCCTTCGCCTCTTC，以100 bp為目的基因片段長度，150 bp為內參片段長度，β-actin內參上游序列為AGGGAAATCGTGCGTGACAT，下游序列為GAACCGCTCGTTGCCAATAG。設置94℃4 min，94℃20 s，60℃30 s，72℃30 s，35個循環為熒光定量PCR擴增條件，取擴增好的目的基因和內參進行瓊脂糖凝膠電泳。紫外分光光度計下拍照觀察，凝膠成像分析儀計算目的基因的改變倍數，結果以2-⊿⊿Ct表示。

2.5 統計學方法

用SPSS 19.0統計軟件對數據結果進行處理分析，數據以均數±標準差（±s）表示。采用單因素方差分析的方法，組間比較采用LSD與SNK法檢驗。以0.05為檢驗水準。

3 結果

3.1 各組小鼠中醫證候評分及心電圖變化

結果見表1、表2。模型組的動物氣虛與血瘀證候積分明顯升高，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；參參康心膠囊各劑量均可降低氣虛與血瘀證候積分，以中劑量組最為顯著（P＜0.01），與地奧心血康組比較有顯著性差異（P＜0.05）。模型組的心率加快，T波幅度下降，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；參參康心膠囊各劑量均可升高T波幅度，降低心率，與模型組比較有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），與地奧心血康組比較有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01），其中以中劑量組最為顯著（P＜0.05）。

表1 各組小鼠氣虛血瘀中醫證候評分（±s，分）

表1 各組小鼠氣虛血瘀中醫證候評分（±s，分）

注：與空白對照組比較aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較cP＜0.05，dP＜0.01；與地奧心血康組比較eP＜0.05（下同）

組別 劑量（g/kg體重）空白對照組模型組地奧心血康組參參康心大劑量組參參康心中劑量組參參康心小劑量組--10.8±0.6b10.9±0.7b0.076 63 1.5氣血證候3.8±0.4 9.5±0.5c9.1±0.6c7.2±0.4de9.8±0.6血瘀證候2.7±0.5 9.7±0.7 9.6±0.5 8.4±0.5de9.9±0.6

表2 各組小鼠心電圖變化（±s，n=15）

表2 各組小鼠心電圖變化（±s，n=15）

組別空白對照組模型組地奧心血康組參參康心大劑量組參參康心中劑量組參參康心小劑量組劑量（g/kg體重） T波幅度（mV）0.267±0.078 0.102±0.031a0.185±0.094c0.157±0.107c0.198±0.040de0.148±0.082c--心率（次/分）650.27±16.63 0.076 1 042.80±15.27b1 012.58±15.67c63 915.62±14.48d840.78±12.21de1.51 010.50±10.76c

3.2 各組小鼠心肌組織Notch1和Jagged1蛋白表達的變化

結果見圖1、表3。模型組Notch1蛋白表達水平明顯下降，Jagged1蛋白表達明顯升高，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；參參康心膠囊各劑量均可升高Notch1蛋白表達水平，以中劑量組最為顯著（P＜0.05），與地奧心血康組比較無顯著性差異；參參康心膠囊各劑量組均可降低Jagged1蛋白表達水平，以中劑量組最為顯著（P＜0.05），明顯優于地奧心血康組（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠心肌組織Notch1和Jagged1蛋白表達的變化

表3 各組小鼠心肌組織Notch1和Jagged1蛋白表達（s，n=15）

表3 各組小鼠心肌組織Notch1和Jagged1蛋白表達（s，n=15）

組別 劑量（g/kg體重）空白對照組模型組地奧心血康組參參康心大劑量組參參康心中劑量組參參康心小劑量組--0.076 63 1.5 1.35±0.05 0.84±0.01a1.12±0.04d0.99±0.03c1.20±0.02d0.86±0.01 Notch1 Jagged1 0.92±0.04 1.17±0.09b1.05±0.03 0.98±0.02c0.80±0.02ce0.93±0.06c

3.3 各組小鼠心肌組織Notch1和Jagged1 mRNA表達的變化

結果見表4。模型組Notch1蛋白表達水平明顯下降，Jagged1蛋白表達明顯升高，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）；參參康心膠囊各劑量均可升高Notch1蛋白表達水平，以中劑量組最為顯著（P＜0.05），與地奧心血康組比較無明顯差異；參參康心膠囊各劑量組均可降低Jagged1蛋白表達水平，以中劑量組最為顯著（P＜0.05），明顯優于地奧心血康組（P＜0.05）。

表4 各組小鼠心肌組織Notch1和Jagged1 mRNA表達的變化（±s，n=15）

表4 各組小鼠心肌組織Notch1和Jagged1 mRNA表達的變化（±s，n=15）

組別 劑量（g/kg體重）空白對照組模型組地奧心血康組參參康心大劑量組參參康心中劑量組參參康心小劑量組--0.076 63 1.5 0.11±0.00 0.07±0.00a0.10±0.00c0.10±0.00c0.11±0.01de0.10±0.00cNotch1 Jagged1 0.11±0.01 3.68±0.24b0.26±0.01d0.37±0.05d0.18±0.02de0.47±0.01d

4 討論

冠心病屬中醫“胸痹”“心痛”范疇。本虛標實為其病理特征，本虛責之于氣、血、陰、陽不足，以心氣不足最為突出，標實主要涉及氣滯、血瘀、痰飲、寒凝、火熱等病理產物或因素，以心絡瘀阻為主。故氣虛血瘀是冠心病的主要中醫發病機制，益氣養心，活血通絡當為冠心病的基本治法。參參康心膠囊由紅參、參三七、水蛭按一定比例組方，經現代制藥工藝研制而成，方中以紅參為君藥，益氣養心，使氣旺促血行，祛瘀而不傷正；三七活血化瘀而又兼止血，既可祛瘀血，又不會使血液妄行，為臣藥；佐以搜剔走竄之水蛭，以活血通絡。全方藥少力專，組方精煉，標本兼顧，使氣旺以促血行，祛瘀而不傷正，共奏益氣養心，活血通絡之效。全方組方嚴謹，藥少力專，尤其適宜于冠心病氣虛血瘀證的治療。我們以往的研究表明，該制劑可減輕阿霉素（ADR）心肌毒性[1]致肌損傷及防治氣虛血瘀型冠心病，其作用機理與抗氧化，清除氧自由基，調節ATP酶活性[2]減輕缺血造成的心肌線粒體水腫，阻止缺血心肌膜損傷，保護心肌超微結構[3]，升高血清6-keto-PGF1α、NO含量，降低TXB2、ET-1含量[4，5]有關。為了進一步揭示冠心病氣虛血瘀證的證候本質，探討參參康心膠囊防治冠心病的作用機理，本研究采用病證結合模型，觀察了冠心病氣虛血瘀證小鼠心肌組織Notch信號通路中Notch1和Jagged1表達的影響及參參康心膠囊的干預作用。

Notch信號通路在哺乳動物的包括心血管[10]在內的各組織器官中廣泛表達。既往對于Notch的研究常局限于腫瘤及發育方面。近年來的研究提示Notch信號通路不但能夠影響胚胎期心臟的發育成型[11]，而且能夠調節成年動物心血管疾病的發生發展[12]。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體（DSL蛋白）、CSL（CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱）DNA結合蛋白等組成。已知哺乳動物有 Notchl/2/3/4 4種 Notch受體和Deltal/2/3/4及Jaggedl/2等5種配體。其中，Jagged1是最早被證實的Notch配體，其廣泛表達于多種組織中并發揮重要生物學作用[13]，不但能夠影響心血管的發生和發育過程，而且能夠影響到各種疾病的發生發展[14]，Jagged1可以與Notch1/2/3等多種受體結合[15]，激活 Notch信號通路，進而激活 Hes1、Nur77及NF-κB等相關轉錄因子調節目的基因轉錄。

本研究采用游泳、高脂飼料饑餓飼養及垂體后葉素（Pit）腹腔注射建立的小鼠模型，中醫證候評分符合氣虛血瘀“證”的特征，心電圖檢測符合冠心病“病”的特征，較成功地建立了冠心病氣虛血瘀證“病證結合”的動物模型。研究顯示模型組Notch1蛋白及其基因表達水平明顯下降，Jagged1蛋白及其基因表達明顯升高，與空白對照組比較有顯著性差異（P＜0.05，P＜0.01）。提示Notch信號通路中Notch1受體及Jagged1配體參與了心肌組織缺血缺氧的病理反應，冠心病氣虛血瘀證可能與Notch信號通路中Notch1及Jagged1有一定的相關性。參參康心膠囊各劑量均可升高Notch1表達水平，降低Jagged1表達水平，以中劑量組最為顯著（P＜0.05），提示參參康心膠囊防治冠心病的機制可能與調節Notch信號通路中Notch1受體及Jagged1配體表達水平有關，中等劑量可能是參參康心膠囊干預冠心病氣虛血瘀證的最佳劑量。

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（*通訊作者：劉喜平）

R965

B

1671-1246（2017）01-0107-04

注：本文系甘肅省中醫藥英才基金項目（GZK-2010-53）