順鉑加重乳腺癌MCF-7細胞DNA損傷促凋亡的研究

袁立明，馬 楠，曹交歡，文 藝，劉向光，周纖纖, 匡淑雯, 陶曉軍，曾趙軍

(1.湖南師范大學醫學院藥物工程實驗室，湖南 長沙 410013；2. 中南大學湘雅醫學院分子生物學研究中心，湖南 長沙 410078)

順鉑加重乳腺癌MCF-7細胞DNA損傷促凋亡的研究

袁立明1，馬 楠2，曹交歡1，文 藝1，劉向光1，周纖纖1, 匡淑雯1, 陶曉軍1，曾趙軍2

(1.湖南師范大學醫學院藥物工程實驗室，湖南 長沙 410013；2. 中南大學湘雅醫學院分子生物學研究中心，湖南 長沙 410078)

目的 順鉑(DDP)為廣譜抗癌藥物，本研究探討其對MCF-7乳腺癌細胞DNA損傷的作用，并研究其引起細胞凋亡的機制。方法 采用DDP(0、2、4、6、8、10 mg·L-1)處理乳腺癌MCF-7細胞48 h,MTT法檢測順鉑對細胞活性的抑制作用，并計算IC50; Western blot檢測DNA斷裂形成的標志分子γ-H2AX及直接感受DNA雙鏈斷裂(DSBs)的分子ATM、細胞凋亡信號分子cleaved caspase-3及凋亡相關的蛋白鈣蛋白酶calpain的表達。結果 DDP呈濃度依賴性抑制細胞MCF-7活性，IC50為7.57 mg·L-1；與對照組(未采用順鉑處理)相比，順鉑處理組 MCF-7細胞內γ-H2AX、ATM、cleaved caspase-3、calpain的表達量增多。結論 DDP可抑制乳腺癌MCF-7細胞的活性，其機制與促進MCF-7細胞凋亡，誘導DNA雙鏈斷裂，上調促凋亡相關蛋白有關。

MCF-7細胞；順鉑；DNA損傷；乳腺癌；增殖；凋亡；IC50

乳腺癌目前已成為威脅婦女生命和健康的頭號殺手，倍受世界各國矚目[1-3]。順鉑(DDP)為廣譜抗癌藥物，具有細胞毒作用，其主要靶點為DNA，與DNA結合可誘導DNA嚴重損傷，從而導致細胞凋亡。DNA雙鍵斷裂(DSBs)是最嚴重的DNA損傷之一，γ-H2AX焦點數和DSBs有1 ∶1的關系,γ-H2AX目前已逐漸成為衡量DNA損傷程度的金標準之一[4]。共濟失調-毛細血管擴張突變基因(ATM)主要介導DSBs誘導的H2AX的磷酸化，并且還能誘導諸多DNA損傷信號通路中的關鍵應激蛋白，其具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性, 可以作用于下游靶蛋白相應絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)位點, 在DNA損傷識別和修復中處于最關鍵的位置[5]。Cleaved caspase-3與化療藥物作用引起細胞凋亡密切相關，cleaved caspase-3在胞質中是以無活性的酶原形式存在, 然而，當許多細胞外凋亡信號使之激活為有活性的cleaved caspase-3時, 引起細胞內關鍵蛋白酶的失活, 導致細胞凋亡[6]。研究表明，鈣蛋白酶calpain與腫瘤細胞的凋亡關系十分密切[7]。本研究旨在分析DDP處理乳腺癌MCF-7細胞后發生DNA損傷時所引起的相關蛋白表達的變化情況，運用MTT法、Hoechst 33258熒光染色及Western blot檢測DDP處理MCF-7細胞后對細胞凋亡、細胞形態學及凋亡相關蛋白表達的影響, 為順鉑作用乳腺癌MCF-7細胞的DNA損傷反應的研究提供相關的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞培養 人乳腺癌細胞株MCF-7細胞，來源于1位69歲高加索婦女乳腺癌(腺癌)患者胸膜滲出液中的癌細胞，該細胞株由中南大學分子生物學研究中心提供。培養體系為含10%小牛血清的DMEM培養基，在37℃、5% CO2孵箱中培養。

1.1.2 試劑 DMEM干粉和小牛血清購于美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Sigma；PVDF膜購于羅氏；30% Acr-Bis、1 mol·L-1Tris-HCl pH 8.8、1 mol·L-1Tris-HCl pH 6.8購自碧云天；預染蛋白Marker購自碧云天；100 bp ladder DNA Marker購自Fermentas。

1.1.3 抗體 ATM鼠抗人單抗購于Abcam公司；γ-H2AX(Ser139)兔抗人單抗購于Bioworld公司；cleaved caspase-3(Asp 175)鼠抗人單抗購于Cell Signaling Technology公司； calpain兔抗人單抗、DAB顯色劑均購自北京中杉生物技術有限公司；二抗羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG均購自碧云天生物有限公司。

1.2 MTT測定DDP作用于MCF-7細胞的的IC50值 將對數生長期的MCF-7細胞接種于96孔培養板中, 每孔加入200 μL，按不同濃度的DDP進行處理(0、2、4、6、8、10 mg·L-1)，每孔加入100 μL無血清的DMEM和20 μL濃度為5 g·L-1的MTT試劑，37℃繼續培養4 h，每孔加入150 μL DMSO，采用490 nm和630 nm波長在酶標儀上檢測各孔吸光度, 記錄結果。用各組不同濃度的細胞抑制率及濃度制作標準曲線, 計算IC50值。細胞抑制率/%=(1-實驗組的平均OD值/對照組的平均OD值)×100%。

1.3 Hoechst 33258熒光染色觀察MCF-7細胞凋亡 將對數生長期MCF-7細胞分別接種于混有不同培養液的培養皿中，分別為空白對照組(0 mg·L-1的DDP)、含5%胎牛血清的DMEM、含10%胎牛血清的DMEM、順鉑組(7.57 mg·L-1DDP的培養基2 mL)，接種96孔培養板，每孔600 μL(1.0 ×105細胞/孔)，48 h后，PBS洗滌細胞，加0.5 mL 10 mg·L-1Hoechst 33258熒光染色，37℃ 孵育8 min，PBS洗滌3次，每次5 min, 熒光顯微鏡下觀察細胞形態，重復3次。

1.4 Western blot 把待處理的MCF-7細胞分為實驗組和對照組，實驗組即DDP組(2、4、6、8、10 mg·L-1)，對照組即空白對照(DDP為0 mg·L-1)。Western blot具體步驟如下:取等質量的各組蛋白質與5×SDS混勻，熱變性5 min后點樣；用Bio-Rad電泳儀在60 V和濃縮膠中電泳1 h，之后在100 V和分離膠中電泳2～4 h(ATM蛋白分子質量為350 ku，SDS-PAGE凝膠電泳采用7.5%的分離膠，同樣的電壓下電泳6 h);Bio-Rad濕轉膜儀在80 V、200 mA條件下轉膜2～3 h(ATM蛋白轉膜6 h)；用含3%脫脂奶粉的TBST溶液4℃封閉2～16 h; 用含3%脫脂奶粉的TBST溶液適當稀釋一抗，4℃孵育過夜；用含3%脫脂奶粉的TBST溶液適當稀釋二抗，室溫孵育1.5 h； 用ECL發光試劑盒對PVDF膜蛋白信號曝光顯色，ImageQuant350化學發光系統照相保存實驗圖片。

1.5 統計學處理 用Image J圖像掃描分析系統分析目標條帶的凈光密度值，以SPSS13.0統計軟件進行One-way ANOVA方差分析。

2 結果

2.1 DDP對MCF-7細胞生長的影響 Fig 1結果顯示，與對照組(0 mg·L-1的DDP)相比較，DDP對MCF-7細胞生長的抑制作用具有濃度依賴性，但最終濃度升高時，抑制作用相對減弱，這可能與細胞產生耐藥性有關。本實驗測得DDP處理MCF-7細胞48 h的IC50為7.57 mg·L-1。

Fig 1 Effect of DDP on cell growth of MCF-7 cell measured by MTT after 48 h(n=3)

2.2 Hoechst 33258熒光染色觀察MCF-7細胞凋亡 Fig 2結果可見，對照組細胞核呈圓形，淡藍色，染色質分布均勻，而DDP處理組細胞核固縮，分葉或碎片狀(即凋亡小體出現)，從結果看，順鉑處理組細胞凋亡增加。

Fig 2 DDP effect on apoptosis morphology of MCF-7 cell

A:NC group;B:DMEM+5% FBS group;C:DMEM+10% FBS group;D:5% glucose group;E:Cisplatin group

2.3 Western blot檢測DDP處理MCF-7細胞后對相關蛋白表達的影響 使用DDP藥物濃度分別為0、2、4、6、8、10 mg·L-1，處理MCF-7細胞48 h，運用Western blot檢測γ-H2AX、ATM、caspase-3、calpain的表達變化。結果顯示(Fig 3～5)，γ-H2AX、ATM、cleaved caspase-3、calpain的表達隨DDP濃度升高而增多。

Fig 3 Protein expressions related toDNA damage,after MCF-7 cells were treated with DDP of different concentrations for 48 h

Fig 4 Protein expressions related tocell apoptosis,after MCF-7 cells were treated with DDP of different concentrations for 48 h

Fig 5 Calpain expressions related tocell apoptosis,after MCF-7 cells were treated with DDP of different concentrations for 48 h

3 討論

乳腺癌是臨床上發病率較高的惡性腫瘤，化療是眾多治療乳腺癌的重要方式之一[8-9]。DDP是臨床治療腫瘤的廣譜抗癌藥，DNA 是DDP的主要靶點，DDP結合會導致 DNA 損傷并誘發細胞凋亡。DSBs是DNA損傷的重要表現形式之一，相關研究表明，γ-H2AX可用于檢測DSBs, 與同類方法相比具有較好的實用價值[4]。ATM是DNA損傷的直接感受器，DNA在損傷之后，ATM因自身磷酸化而被迅速激活，即使只有少量的DSBs也會促使ATM發生結構的改變[5]。

本次實驗中， DDP處理MCF-7細胞48 h后，隨藥物濃度升高，γ-H2AX與ATM表達量均升高，造成其損傷，進一步影響了一些基因的表達與蛋白的改變。 經7.57 mg·L-1DDP作用 48 h 后, 在排除其他培養基相應成分干擾的前提下，Hoechst 33258染色結果顯示, MCF-7細胞的細胞核固縮，分葉或碎片狀，核內染色質因為濃集而呈亮藍色，從形態學角度可以知道, 順鉑明顯誘導MCF-7細胞發生了凋亡，超過了其自身修復的能力。

Western blot結果顯示，不同濃度的DDP作用MCF-7細胞后，作為細胞凋亡必不可少的關鍵酶cleaved caspase-3被激活，通過caspase級聯反應，促使與細胞凋亡相關的重要蛋白降解，從而引起細胞凋亡。細胞內的鈣蛋白酶calpain是一類Ca2+依賴性的半胱氨酸蛋白酶，可催化多種底物限制性水解。研究者們多數認為鈣蛋白酶與caspase家族共同介導細胞凋亡。有研究發現，鈣蛋白酶可以通過水解caspase-7、caspase-10和caspase-12產生活性更強的水解底物，從而促進caspase誘導的細胞凋亡[10]。 近來研究也證實了鈣蛋白酶可以通過裂解凋亡相關的Bcl-2家族，以及通過水解途徑激活其他促凋亡途徑物質如CDK5、APAF1、JNK、JUN、FOS等介導細胞凋亡[11]。這與本實驗得到的calpain表達量在MCF-7細胞被給予DDP之后隨濃度升高而增多相一致，進一步證實了鈣蛋白酶calpain與細胞凋亡有關。這提示我們，抑制細胞內calpain的表達可能對于腫瘤的治療有促進作用，也為研究calpain的功能提供了科學依據。

綜上所述，DDP通過誘導乳腺癌MCF-7細胞DNA損傷，上調與細胞凋亡相關的蛋白表達，從而引起細胞凋亡。

(致謝：本實驗在中南大學湘雅醫學院分子生物學研究中心實驗室完成。)

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Study of cisplatin aggravating DNA damage and causing a high apoptosis rate on breast cancer MCF-7 cells

YUAN Li-ming1,MA Nan2,CAO Jiao-huan1,WEN Yi1,LIU Xiang-guang1,ZHOU Xian-xian1,KUANG Shu-wen1,TAO Xiao-jun1,ZENG Zhao-jun2

(1.LaboratoryofMedicineEngineering,MedicalCollegeofHunanNormalUniversity,Changsha410013,China;2.MolecularBiologyResearchCenter,XiangyaMedicalCollege,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China)

Aim To investigate the mechanisms of DNA damage of cisplatin(DDP), a broad spectrum anticancer drug on breast cancer MCF-7 cells and to study the mechanism of apoptosis induced by DDP.Methods MCF-7 cells were treated by DDP(0, 2,4,6,8,10 mg·L-1) for 48 h. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of DDP on MCF-7 cells, and IC50value was calculated. Western blot was adopted to detect the expression of γ-H2AX,which was the marker of DNA double stranded breaks(DSBs) and ATM(sensory molecules of DSBs), the apoptotic signal transduction molecule cleaved caspase-3, and the proteins associated with apoptosis:calpain.Results DDP inhibited MCF-7 cell activity in a concentration-dependent manner and IC50was 7.57 mg·L-1.In contrast to the control group(without DDP treatment), MCF-7 cells with DDP treatment group expressed more γ-H2AX, ATM, cleaved caspase-3 and calpain.Conclusions DDP could inhibit the activity of breast cancer MCF-7 cells. Its mechanisms may be associated with inhibition of MCF-7 cell apoptosis, induction of DNA double strand breaking and the expression of pro-apoptotic protein up-regulating.

MCF-7 cell; cisplatin; DNA damage; breast cancer; proliferation; apoptosis；IC50

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.018.html

2016-10-25,

2016-11-28

國家自然科學基金資助項目(No 30600753，81172154)；湖南省自然科學基金面上項目(No 2016JJ2088);湖南省教育廳資助項目(No 13C541); 湖南省中醫藥管理局資助項目(No 2015123)

袁立明(1972-),男，碩士，研究方向：惡性腫瘤的自殺基因治療及應用解剖學,E-mail: yuanlimingtian@126.com; 陶曉軍(1981-)，男，博士，講師，研究方向：納米藥物制劑緩控釋和靶向治療,通訊作者，E-mail: xiaojtao@126.com； 曾趙軍(1971-)，男，博士，副教授，研究方向：人類腫瘤基因治療、腫瘤DNA損傷與修復、基因的結構與功能的機制,通訊作者，E-mail: zengzj71@sina.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.009

A

1001-1978(2017)03-0334-04

R329.25；R342.3；R737.9；R979.1