胰高血糖素樣肽-1對AGEs誘導H9C2心肌細胞自噬的影響

張 軍，谷 翔，黃問銀，張普華，于 歡，殷嫦嫦，王麗麗，毛衛未

(1.南昌大學研究生院醫學部,江西 南昌 330006;2.九江學院附屬醫院心內科,江西 九江 332000；3. 九江學院轉化醫學實驗室,江西 九江 332000)

胰高血糖素樣肽-1對AGEs誘導H9C2心肌細胞自噬的影響

張 軍1，2，谷 翔1，2，黃問銀2，張普華2，于 歡3，殷嫦嫦3，王麗麗3，毛衛未2

(1.南昌大學研究生院醫學部,江西 南昌 330006;2.九江學院附屬醫院心內科,江西 九江 332000；3. 九江學院轉化醫學實驗室,江西 九江 332000)

目的 觀察胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)對晚期糖基化終產物(AGEs)誘導H9C2心肌細胞自噬(Autophagy)的影響，初步探討GLP-1心肌細胞保護作用與自噬活性關系。方法 將傳代培養H9C2心肌細胞隨機分4組：① Control組：加入0.9%生理鹽水；② AGEs組：加入100 mg·L-1AGEs；③ AGEs+GLP-1組：同時加入100 mg·L-1AGEs和10 nmol·L-1GLP-1；④ AGEs+GLP-1+Rapamycin組：同時加入100 mg·L-1AGEs、10 nmol·L-1GLP-1及5 μmol·L-1Rapamycin(自噬誘導劑)。各組在經上述預處理24 h后，分別用CCK-8法檢測細胞存活率Hoechst 33258試劑盒檢測細胞的凋亡率，DCFH-DA熒光探針檢測細胞內活性氧(ROS)水平，流式細胞術檢測細胞自噬溶酶體形成，Western blot法檢測自噬相關蛋白(LC3Ⅱ, Beclin-1)表達。結果 ① 與Control組相比，AGEs組細胞生存率明顯減少，細胞內ROS水平明顯增高，細胞自噬溶酶體水平及自噬相關蛋白(LC3Ⅱ、 Beclin-1)表達均明顯增加；② 與AGEs組相比，AGEs+GLP-1組細胞生存率明顯增高，細胞內ROS水平、細胞自噬溶酶體水平及自噬相關蛋白(LC3Ⅱ、Beclin-1)表達均明顯下降；③ 與AGEs組相比，AGEs+GLP-1+rapamycin組中細胞內ROS水平降低，而細胞生存率、細胞自噬溶酶體水平及自噬相關蛋白(LC3Ⅱ、 Beclin-1)表達未見差異。結論 ① AGEs可導致H9C2心肌細胞內ROS升高，誘導細胞損傷并激活細胞自噬；② GLP-1對AGEs誘導的H9C2心肌細胞損傷具有保護作用，其保護機制可能與抑制細胞自噬活性有關。

胰高血糖素樣肽素-1;糖基化終產物; H9C2心肌細胞;自噬;活性氧;細胞保護

晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)是過量糖與蛋白質、脂質、核酸之間經非酶糖基化反應的終末產物，可通過誘導活性氧(ROS)、細胞凋亡及炎性反應等導致細胞損傷或死亡，在糖尿病心肌病發生發展過程中發揮重要作用[1]。最近研究發現，自噬作為糖尿病心肌病的新穎發病機制，在調節AGEs誘導的心肌細胞凋亡、ROS誘導的糖尿病心肌損傷等方面的作用引起關注[2-3]，有望成為糖尿病心肌病治療的潛在靶向機制。

胰高血糖素樣肽(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是機體中一種具有“腸促胰素效應”的腸源性激素，在發揮綜合降糖作用外，還可影響糖尿病心肌病的多種發病機制，其中包括緩解糖尿病心肌內質網應激、減少高糖誘導的心肌細胞凋亡等[4-5]。此外，GLP-1還可通過抑制自噬保護高糖誘導的人腎小管上皮細胞損傷[6]，通過減少氧化應激改善冠脈血管內皮損傷[7]，以及減少急性心肌梗死面積及心梗后心肌重構等[8]，這些研究結果提示GLP-1在糖尿病心肌病中的作用及機制值得進一步探究。本研究通過觀察GLP-1對AGEs誘導的H9C2心肌細胞ROS及自噬影響，初步探討自噬在GLP-1糖尿病心肌損傷中的保護作用及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 H9C2大鼠心肌細胞株由南昌大學第二附屬醫院實驗室細胞庫惠贈。AGEs (121800，Calbiochem公司，美國)，DMEM-F12培養基(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(BI公司，以色列)，GLP-1(Sigma公司，美國)，活性氧檢測試劑盒、細胞計數CCK- 8試劑盒(碧云天生物技術研究所，中國)，兔抗老鼠GAPDH(10494-1-AP)多克隆抗體(Peprotech公司，美國)，LC-3B(#3868) 、Beclin1(#3495)(CST公司，美國)，吖啶橙(索萊寶公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 H9C2細胞株復蘇后，接種于15% 胎牛血清DMEM-F12培養液中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。在細胞貼壁80%時，用0.25%胰酶消化，取對數生長期的細胞并接種于6孔板中，分別加入0.9%生理鹽水、100 mg·L-1AGEs、100 mg·L-1+10 nmol·L-1GLP-1、100 mg·L-1+10 nmol·L-1GLP-1+5 μmol·L-1rapamycin，并在培養箱中培養24 h后進行各項指標檢測。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞成活率 按照CCK- 8試劑盒說明書操作流程，取對數生長期細胞，以2×107·L-1細胞濃度接種于96孔板中，在37 ℃培養箱中培養2 h后，用酶標儀(Elx800，BioTek，美國)記錄450 nm波長處的吸光度。取4孔光密度(optical density，OD)的平均值，按下列公式計算細胞存活率：生存率/%=(OD處理組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。實驗重復3次。

1.2.3 Hoechst 33258核染色法檢測心肌細胞凋亡 H9C2心肌細胞經不同因素處理后,小心棄去培養基，PBS洗1遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗后，加入5 mg·L-1Hoechst 33258試劑，室溫輕搖30 min。在熒光顯微鏡(BX50-FLA,Olympus,Japan)下攝片,染色質均勻分布,核被染成均勻藍色的細胞認為是正常細胞，核呈濃縮、碎裂的明亮藍色細胞認為是凋亡細胞，隨機選取視野在熒光顯微鏡下攝片。

1.2.4 DCFH-DA熒光探針檢測細胞內ROS水平 根據活性氧試劑盒操作流程，標本用10 μmol·L-1DCFH-DA 染液于37 ℃孵育20 min。在熒光顯微鏡下隨機選取5個不重復區攝片，用 Image J 1.410軟件分析4個視野綠色熒光強度的平均值，再對每組的各樣本進行統計分析。

1.2.5 流式細胞儀檢測自噬溶酶體水平 收集H9C2 細胞，用預冷的PBS洗1次，1 000 r·min-1離心5 min后，加入已配制好的等體積吖啶橙(Acridine orange,AO)染色液，冰上染色10～15 min，樣品在1h內用流式細胞儀(BD FACSCalibur，美國)檢測細胞自噬溶酶體水平(激發光488 nm)。

1.2.6 Western blot測定自噬相關蛋白表達 收集H9C2細胞，用預冷的PBS洗滌3次，RIPA全細胞裂解液冰上裂解30 min，離心取上清，BCA法進行蛋白定量。每孔蛋白上樣量30 μg在0.1聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中進行電泳70 V，電泳15～20 min，待指示劑到濃縮膠與分離膠交界處后，改為120 V繼續電泳，直至溴酚藍完全到凝膠底部停止電泳。置于電轉液中，在250 mA恒定電流下將蛋白轉移至PVDF膜上。50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h，LC3B、Beclin1一抗(1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育1 h，漂洗3次，ECL顯色。用ECL 檢測液發光顯影定影后，用Image J軟件進行灰度分析。

2 結果

2.1 GLP-1減少AGEs誘導 H9C2心肌細胞損傷

2.1.1 各組細胞形態學特征 在倒置顯微鏡下，各組細胞形態學特征表現為：Control組細胞呈梭形，排列規整，大小均一，胞核、胞質境界清楚；AGEs組細胞大小不規則，一些胞體變圓、皺縮，胞核增大，胞質有空泡出現；AGEs+GLP-1組細胞大小較為均一，形態趨向正常，細胞皺縮變形和胞質空泡化減少；與AGEs+GLP-1組相比，AGEs+GLP-1+rapamycin組細胞形態學損傷較為嚴重(Fig 1)。

Fig 1 Cellular morphology observation(×400)

A：Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin

2.1.2 各組細胞生存率檢測結果 CCK-8法檢測各組細胞存活率結果顯示，與Control組相比，AGEs 組細胞生存率明顯減低(70.16±1.98vs93.37±3.66，P<0.01)；AGEs+GLP-1組較AGEs組明顯提高細胞生存率(80.66±1.78vs70.16±1.98，P<0.05)。見Tab 1。

GroupCellviability%ofcontrol(x±sdeviations)Normalcontrol93.37±3.73100mg·L-1AGEs70.16±1.98##100mg·L-1AGEs+10nmol·L-1GLP-180.66±1.78*100mg·L-1AGEs+10nmol·L-1GLP-1+5μmol·L-1rapamy-cin71.58±3.36

##P<0.01vscontrol;*P<0.05vs100 mg·L-1AGEs group.

2.1.3 各組細胞凋亡率檢測結果 Hoechst 33258核染色檢測結果顯示,與Control比較，100 mg·L-1AGEs處理H9C2心肌細胞24 h能使H9C2細胞凋亡率明顯增加；與100 mg·L-1AGEs組損傷相比100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP+5 μmol·L-1Rapamycin與100 mg·L-1AGEs組對比，細胞凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)。見Fig 2。

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.##P<0.01vscontrol;*P<0.05vsAGEs group.

2.2 GLP-1降低AGEs誘導H9C2心肌細胞內ROS產物 運用熒光探針DCFH-DA對各組心肌細胞內ROS進行標記，用Image J 1.410軟件分析熒光強度結果顯示(Fig 3)，AGEs組熒光強度明顯高于Control組(P<0.01)；與AGEs組相比，AGEs+GLP-1組熒光強度明顯減弱(P<0.05)；以上結果提示，AGEs可導致H9C2心肌細胞內ROS升高，GLP-1干預后可明顯降低AGEs誘導的細胞內ROS產物。

Fig 3 Effect of GLP-1 on AGEs-induced

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.##P<0.0 1vscontrol;*P<0.05vs100 mg·L-1AGEs group.

2.3 GLP-1抑制AGEs誘導的H9C2心肌細胞自噬

2.3.1 流式細胞術檢測細胞自噬溶酶體水平結果 A為正常Control組；B為AGEs組；C為AGEs+GLP-1組，D為AGEs+GLP-1+Rapamycin組。運用吖啶橙(Acridine orange, AO)對細胞內酸性囊泡細胞器(包括自噬溶酶體)進行染色標記，經流式細胞儀檢測AO熒光強度結果顯示(Fig 4)，AGEs組平均熒光強度明顯高于Control組(3 302.03±9.84vs162.05±3.20，P<0.01)；在經GLP-1干預后顯示，AGEs+GLP-1組平均熒光強度較AGEs組明顯減低(2 756.67±3.84vs3 302.03±9.84，P<0.05)；用Rapamycin進一步干預后，AGEs+GLP-1+Rapamycin組平均熒光強度與AGEs組差異無顯著性(3 206±8.80vs3 302.03±9.84，P>0.05)。上述結果提示，GLP-1可明顯減少細胞自噬溶酶體水平，Rapamycin干預后可削弱GLP-1對細胞自噬溶酶體作用效果。

Fig 4 Effect of GLP-1 on AGEs-induced

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.

2.3.2 Western blot法檢測自噬相關蛋白表達結果 運用免疫印跡方法分別檢測50、100、200 mg·L-1濃度AGEs對H9C2心肌細胞LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達影響。結果顯示，隨著AGEs濃度升高，LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達逐步增強，根據實驗結果選用100 mg·L-1AGEs作為最適宜自噬激活濃度。與Control組相比，AGEs組中LC3Ⅱ、Beclin1表達均明顯增高(P<0.05)，表明AGEs可明顯激活自噬，該結果與流式細胞檢測結果基本一致；在經GLP-1干預后，自噬相關蛋白表達均明顯降低(AGEs+GLP-1組vsAGEs組，P<0.05)(Fig 5)，提示GLP-1可能具有抑制自噬作用。

為了進一步驗證GLP-1通過抑制細胞自噬產生心肌損傷保護作用，本研究運用自噬誘導劑rapamycin對GLP-1作用進行干預，結果顯示，rapamycin可明顯削弱GLP-1對自噬相關蛋白表達的影響(AGEs+GLP-1+Rapamycin組vsAGEs組，P>0.05)。因此，結合rapamycin對細胞損傷和細胞內ROS影響(Fig 1、Tab 1、Fig 2、Fig 3)，本結果提示，GLP-1可通過抑制自噬保護AGEs誘導的H9C2心肌細胞損傷。

Fig 5 Effect of GLP-1 on the autophagy LC3BⅡ,

A:Control;B:AGEs;C:AGEs+GLP-1;D:AGEs+GLP-1+Rapamycin.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsAGEs group

3 討論

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM )是一種由多重致病機制共同參與的心肌疾病，其中，AGEs在DCM發病進程中的作用尤為關鍵[9-10]。AGEs可通過兩種途徑參與DCM致病過程：① 直接導致膠原蛋白分子交聯，抑制膠原蛋白降解，進而增加心肌間質纖維化；② 與其受體RAGE結合，誘導ROS形成、炎性反應，進而激活一系列信號轉導途徑導致心肌細胞損傷[1,11]。最近研究發現，AGEs還可通過與RAGE結合，抑制PI3K/AKT/mTOR途徑從而激活自噬引起心肌細胞損傷[12]。因此，自噬在AGEs誘導的心肌細胞損傷過程中的調節作用值得深入探討。

GLP-1是由腸道L型細胞分泌的一種腸促胰島素(incretin)，通過促進胰島細胞增殖、胰島素分泌，抑制胰島細胞凋亡、胰高血糖素分泌，發揮綜合降血糖的生物學功效。在內皮細胞、胰島細胞等研究中發現，GLP-1還可通過降低RAGE表達、減少ROS形成或抑制細胞凋亡，發揮抗AGEs誘導的細胞損傷作用[13-15]。 最近研究也證實，AGEs可誘導RAGE受體表達，而GLP-1可抑制RAGE表達及細胞凋亡，進而提高心肌細胞存活率[16-17]。上述研究結果表明，GLP-1對AGEs誘導的細胞損傷保護機制，可能與減少ROS形成、降低RAGE表達及抑制細胞凋亡有關。

本研究結果顯示，AGEs可明顯誘導H9C2心肌細胞損傷，主要表現為：與Control組相比，AGEs組出現胞體變形、胞核增大、胞質見空泡等細胞形態學損傷；細胞生存率檢測結果也顯現較低水平。結合ROS檢測結果分析，AGEs 組中細胞內ROS升高可能與AGEs誘導的細胞損傷有關，且其損傷程度隨AGEs濃度升高而增加。在經GLP-1干預后顯示，GLP-1可明顯降低由AGE誘導的細胞內ROS形成，并有效改善細胞損傷。以上結果表明，GLP-1可能通過減少細胞內ROS形成而發揮抗AGEs誘導的H9C2心肌細胞損傷作用。

AGEs是誘導細胞內ROS升高的重要原因之一[18]，ROS異常升高除直接通過氧化反應造成細胞DNA、蛋白質損傷外，還可作為信號分子激活細胞內多種應激敏感信號通路，包括自噬信號通路。研究表明，在氧化應激狀態下，ROS升高可通過多種分子信號通路誘導自噬發生，而自噬激活后也可通過線粒體自噬、分子伴侶自噬(CMA)等途徑來降低ROS水平[19]。目前認為，ROS與自噬之間這種負向反饋機制一般發生在ROS輕微升高情況下，是機體應對氧化應激的一種代償調節機制；而當ROS過多增高時，自噬會被過度激活，ROS與自噬之間將形成正向反饋調節，誘導細胞進入自噬型細胞死亡[20-22]。從本研究結果分析，AGEs誘導的細胞損傷、ROS升高及自噬活性上調，在經GLP-1干預后出現明顯緩解或下降，推測GLP-1可能通過減少ROS形成，將ROS與自噬之間正向反饋關系轉變成負向反饋，從而減少由正向反饋帶來的不良后果。

為了進一步驗證GLP-1心肌保護作用與自噬活性關系，本研究運用自噬誘導劑rapamycin干預發現，rapamycin在不影響ROS水平情況下，可明顯削弱GLP-1對AGEs誘導的心肌細胞損傷保護作用，并有效地干擾了GLP-1對自噬溶酶體形成及自噬相關蛋白表達影響。上述結果提示，在AGEs環境下，GLP-1心肌保護作用與自噬抑制存在一定關聯，其保護機制除了涉及ROS介導的自噬外，可能還存在其他自噬調節途徑。因此，從本研究結果分析，GLP-1對AGEs誘導的H9C2心肌細胞損傷具有保護作用，其保護機制可能部分通過抑制ROS介導的自噬來實現。

(致謝：本實驗于九江學院基礎醫學院轉化醫學實驗室完成。本實驗主要參與人谷翔、殷嫦嫦、李衛東老師給予課題設計及修改；黃問銀、王麗麗老師給予實驗技術指導；張普華、管高鵬、陳文杰同學給予具體實驗上的幫助。)

[1] Bugger H, Abel E D. Molecular mechanisms of diabetic cardiomyopathy[J].Diabetologia,2014,57(4): 660-71.

[2] Hu P F, Zhou H,Lu M, et al. Autophagy plays a protective role in advanced glycation end product-induced apoptosis in cardiomyocytes[J].CellPhysiolBiochem,2015,37(2): 697-706.

[3] Kobayashi S, Liang Q. Autophagy and mitophagy in diabetic cardiomyopathy[J].BiochimBiophysActa,2015,1852(2): 252-61.

[4] Liu J, Liu Y, Chen L, et al. Glucagon-like peptide-1 analog liraglutide protects against diabetic cardiomyopathy by the inhibition of the endoplasmic reticulum stress pathway[J].JDiabetesRes，2013，2013:630537.

[5] Younce C W, Burmeister M A, Ayala J E. Exendin-4 attenuates high glucose-induced cardiomyocyte apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress and activation of SERCA2a[J].AmJPhysiolCellPhysiol，2013，304(6): C508-18.

[6] Zhao X, Liu G, Shen H, et al. Liraglutide inhibits autophagy and apoptosis induced by high glucose through GLP-1R in renal tubular epithelial cells[J].IntJMolMed，2015，35(3): 684-92.

[7] Wang D, Luo P, Wang Y, et al. Glucagon-like peptide-1 protects against cardiacmicrovascular injury in diabetes via a cAMP/PKA/Rho-dependent mechanism[J].Diabetes，2013，62(5):1697-708.

[8] Yin M, Westenbrink B D, Meissner M, et al. Variable effects of anti-diabetic drugs in animal models of myocardial ischemia and remodeling: a translational perspective for the cardiologist. Int[J].JCardiol，2013，169(6): 385-93.

[9] Singh V P, Bali A, Singh N, Jaggi A S. Advanced glycation end products and diabetic complications[J].KoreanJPhysiolPharmacol，2014，18(1):1-14.

[10]Ramasamy R, Yan S F,Schmidt A M. Receptor for AGE (RAGE): signaling mechanisms in the pathogenesis of diabetes and its complications[J].AnnNewYorkAcadSci，2011，1243:88-102.

[11]Bodiga V L, Eda S R, Bodiga S. Advanced glycation end products: role in pathology of diabetic cardiomyopathy[J].HeartFailRev，2014，19:49-63.

[12]Hou X W,Hu Z H, Xu H Y,et al. Advanced glycation end products trigger autophagy in cardiomyocyte Via RAGE/PI3K/AKT/mTOR pathway[J].CardiovascDiabetol,2014,13:78.

[13]Ishibashi Y,Matsui T,Takeuchi M,Yamagishi S I. Glucagon-like peptide-1(GLP-1) inhibits advanced glycation end product(AGE)-induced up-regulation of VCAM-1 mRNA levels in endothelial cells by suppressing AGE receptor(RAGE) expression[J].BiochemBiophysResCommun,2010,391(3):1405-8.

[14]Puddu A,Storace D,Durante A,et al.Glucagon-like peptide-1 counteracts the detrimental effects of advanced glycation end-products in the pancreatic beta cell line HIT-T 15[J].BiochemBiophysResCommun,2010,398(3): 462-6.

[15]Zhan Y,Sun H L,Chen H, et al. Glucagon-like peptide-1(GLP-1) protects vascular endothelial cells against advanced glycation end products(AGEs)-induced apoptosis[J].MedSciMon,2012,18(7): BR286-91.

[16]Yi B, Hu X, Wen Z, et al. Exendin-4, a glucagon-like peptide-1 receptor agonist, inhibits hyperglycemia-induced apoptosis in myocytes by suppressing receptor for advanced glycation end products expression[J].ExpTherMed,2014,8:1185-90.

[17]張秋艷，唐 靈，王 艷，等.絞股藍皂苷對AGEs誘導下人腎小球系膜細胞中RAGE及轉化生長因子-β1表達的影響[J].中國藥理學通報,2016,32(9):1301-6.

[17]Zhang Q Y，Tang L，Wang Y，et al.Effect of gypenosides on RAGE and TGF-β1expression in human mesangial cells induced by AGEs[J].ChinPharmacolBull,2016,32(9):1301-6.

[18]Panigrahy S K, Bhatt R, Kumar A. Reactive oxygen species: sources, consequences and targeted therapy in type 2 diabetes[J].JDrugTarget,2016,19:1-9.

[19]Li L, Tan J, Miao Y, et al. ROS and autophagy: interactions and molecular regulatory mechanisms[J].CellMolNeurobiol,2015,35(5):615-21.

[20]Zhang X, Yu L, Xu H. Lysosome calcium in ROS regulation of autophagy[J].Autophagy,2016,12(10):1954-5.

[21]Dadakhujaev S, Jung E J, Noh H S,et al.Interplay between autophagy and apoptosis in TrkA-induced cell death[J].Autophagy,2009,5(1):103-5.

[22]Morales C R, Pedrozo Z, Lavandero S, Hill J A. Oxidative stress and autophagy in cardiovascular homeostasis[J].AntioxidRedoxSignal,2014,20(3):507-18.

The protective effect of glucogon like peptide-1 on H9C2 cardimyocytes against AGEs-induced injury by inhibiting excessive autophagy

ZHANG Jun1，2,GU Xiang1,HUANG Wen-yin1,ZHANG Pu-hua1,YU Huan3,YIN Chang-chang3,WANG Li-li3,MAO Wei-wei1

(1.DeptofCardiology,AffiliatedHospitalofJiujiangUniversity,JiujangJiangxi332000,China; 2.MedicineGraduateSchool,NanchangUniversity,Nanchang330006,China;3.BasicMedicalCollegeofJiujangUniversity,JiujangJiangxi332000,China)

Aim To investigate the effect of glucogon like peptide-1 on H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced injury and potential protective mechanisms of autophagy.Methods Cultured H9C2 cardiomyocytes were respectively incubated with 0.9% NaCl,100 mg·L-1AGEs,100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1,100 mg·L-1AGEs+10 nmol·L-1GLP-1+5 μmol·L-1rapamycinfor 24 h. Intracellular ROS production was measured by DCFH-DA fluorescent probe.Cell viability was quantified by CCK-8 assay. Nucleus morphology was observed under fluorescence microscope after being incubated with Honchest 33258.The formations of autolysosomes were detected by flow cytometry using the PH-sensitive fluorescent dye acridine orange(OA). Western blot was applied to assess the expression of autophagy-associated protein including LC3Ⅱ, Beclin-1.Results AGEs impaired cell viability, increased intracellular ROS production, enhanced formation of autolysosomes and up-regulated expression of LC3Ⅱand Beclin-1; however, the effect were reversed remarkably by GLP-1. Furthermore, effect of GLP-1 was inhibited by rapamycin(autophagy agonist) in cell viability, amount of autolysosomes, and expression of autophagy-associated protein but not in intracellular ROS production.Conclusion GLP-1 may protect H9C2 cardiomyocytes against AGEs-induced injury partly by inhibiting excessive autophagy.

GLP-1;AGEs;H9C2 cardiomyocytes;Autophagy;ROS;myocardial preservation

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.024.html

2016-10-24,

2016-12-05

國家自然科學(地區)基金項目(No 81660152);江西省教育廳科技項目(No GJJ09350)

張 軍(1989-)，男，碩士，醫師，研究方向：糖尿病心肌病發病機制，E-mail：15079265586@163.com； 谷 翔(1967-)，男，博士，主任醫師，教授，碩士生導師，研究方向：糖尿病心肌病、心肌缺血/再灌注的發病機制,通訊作者,E-mail：eagle0094@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.012

A

1001-1978(2017)03-0348-06

R329.24；R329.25；R329.411；R587.2；R977.6