蛇毒金屬蛋白酶抑制劑重組蛋白抗腫瘤血管生成作用及其機制

紀明開,陳麗紅,程 波,師 儀,林 旭,林建銀

(1.福建醫科大學附屬第一醫院皮膚科，福建 福州 350004；2.福建省腫瘤醫院病理科，福建 福州 350014；3.福建醫科大學分子醫學研究中心，消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，福建 福州 350004)

蛇毒金屬蛋白酶抑制劑重組蛋白抗腫瘤血管生成作用及其機制

紀明開1,3,陳麗紅1,程 波1,師 儀2,林 旭3,林建銀3

(1.福建醫科大學附屬第一醫院皮膚科，福建 福州 350004；2.福建省腫瘤醫院病理科，福建 福州 350014；3.福建醫科大學分子醫學研究中心，消化道惡性腫瘤教育部重點實驗室，福建 福州 350004)

目的 研究蛇毒金屬蛋白酶抑制劑重組蛋白(recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor，rSVMPI)對血管生成的影響及其分子機制。方法 應用雞胚絨毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)血管生成模型觀察SVMPI重組蛋白對血管生成的影響；采用Alamar Blue分析方法檢測人臍靜脈內皮細胞(human umbilical veins endothelial cells,HUVECs)增殖能力、Annexin V-FITC雙標記流式細胞術檢測細胞凋亡、劃痕標記法檢測細胞體外遷移能力、Boyden小室分析方法檢測細胞體外趨化能力及管腔形成法檢測體外血管新生能力；通過real-time PCR及Western blot檢測重組蛋白處理后的HUVECs KDR、FGFR-1表達。結果 rSVMPI減少雞胚尿囊膜新生血管密度指數，減弱由VEGF誘導的HUVECs趨化能力，抑制HUVECs體外新生小管的形成，降低HUVECs細胞KDR和FGFR-1的表達水平。結論 rSVMPI可能通過阻斷VEGF-KDR或bFGF-FGFR信號轉導途徑，發揮抑制血管生成的作用。

蛇毒；基質金屬蛋白酶抑制劑；重組蛋白；表達純化；血管生成； 信號轉導

腫瘤血管生成是腫瘤生長、侵襲和轉移的關鍵步驟，也是腫瘤靶向治療的主要研究領域之一，抑制腫瘤血管生成已被公認為一種較為有效的抗癌策略[1]。近年來許多研究表明，作為基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)抑制物的基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)，除了抑制MMP的活性外，還具有抑制血管生成的作用[2]。

蛇毒金屬蛋白酶抑制劑SVMPI是來自美洲矛頭蝮(Bothrops jararaca)血清的一類金屬蛋白酶抑制劑，屬cystatin超家族的胎球蛋白(fetuin)家族成員，具有抗腫瘤侵襲轉移作用的潛能。實驗室前期已成功構建畢赤酵母表達質粒pPICZαA-SVMPI，獲得GS115-SVMPI轉化子，建立穩定的蛇毒金屬蛋白酶抑制劑重組蛋白(recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor，rSVMPI)制備工藝，獲得高純度、高活性的rSVMPI。我們前期研究結果表明，rSVMPI可抑制腫瘤細胞MMP-2/MMP-9的活性，我們推斷rSVMPI可能具有抑制血管生成的作用。另外，本實驗室的前期工作亦表明rSVMPI具有抑制小鼠黑色素瘤細胞B16F10 和人肝癌細胞MHCC97H腫瘤血管生成作用的潛能[3]。為此，本研究應用雞胚尿囊膜血管生成模型及分子生物學技術，進一步觀察和評價rSVMPI對血管生成的影響及其分子機制，為將rSVMPI開發為抗腫瘤侵襲轉移的新藥提供理論依據和實驗基礎。

1 材料

1.1 菌株、細胞與種蛋 GS115-SVMPI菌株由本實驗室構建保存；原代人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)取自健康剖腹產孕婦的臍靜脈。種蛋購自福州農工商種禽公司。

1.2 試劑與儀器 酵母培養基YNB(yeast nitrogen base )和EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit購自Invitrogen公司；蛋白胨(peptone)購自Sigma公司；酵母提取物購自Difco公司；Prestained protein ladder(P7709)購自New England BioLab公司； BCA蛋白濃度測定試劑盒為碧云天公司產品；Ni Sepharose 6 Fast Flow(Cat#:17-0921-07)為GE Healthcare產品；M199培養基、胰蛋白酶/EDTA、胎牛血清購自美國Gibco公司； vWF(Cat#: sc-21784)、FGFR-1(Cat#: sc-121)、KDR (Cat#: sc-48161) 一抗均為Santa Cruz公司產品；SP超敏試劑盒、DAB顯色系統購自福州邁新公司，其余試劑均為進口或國產分析純。

凝膠成像系統(Syngene公司)；大容量搖床(Thermo Electron公司)；大容量冷凍離心機(Beckman公司)；垂直蛋白電泳儀(Pharmacia Biotech公司)；電穿孔儀(Gene Pulser II BioRad 公司)；超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術公司)；熒光分光光度計[Spectrofluorophotometer, RF-5301(PC)S, Shimadzu corporation, Japan]； AKTATMprime protein purification system(GE通用公司)；Rotor-Gene 3000 real-time PCR system(Corbett Research,UK)；Model 550 酶標儀(Bio-Rad 公司)；流式細胞儀(美國貝克曼公司)。

2 方法

2.1 SVMPI在巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)系統中的分泌表達、純化、鑒定及保存 根據文獻[4]，將GS115-SVMPI菌接種于含25 mL BMGY培養液的搖瓶中，添加純甲醇誘導，離心，收集上清，加入ProBondTM樹脂純化柱純化，收集純化蛋白進行11%Tris-Tricine電泳后，將蛋白電轉移至PVDF轉印膜(Amersham)，進行免疫印跡分析。一抗為鼠抗c-myc單克隆抗體(購自Invitrogen公司，以封閉液1 ∶1 000稀釋后使用)，二抗、封閉液、洗液及化學發光檢測系統均WesternBreeze Chromogenic Western Blot Immunodetection Kit(Cat#: WB7105, Invitrogen)組分，具體操作參見試劑盒說明書。將上述純化后的重組蛋白進行Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析(4%濃縮膠、11%分離膠)，R-250染色過夜。質譜測定：分離目的蛋白，送復旦大學生物醫學研究院測定。

2.2 rSVMPI對雞胚尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane，CAM)血管生成的影響[5]7 d雞胚蛋酒精擦拭消毒后，放37℃培養箱孵育，鈍端(大頭端)氣室向上，呈45°傾斜放置。將胚蛋置檢卵燈下尋找氣室位置，在距胚頭前1 cm，兩條前卵黃靜脈之間的卵殼投影部位或正對雞胚的位置，標記1.0 cm×1.5 cm的開窗位置，75%酒精消毒后，用牙科鉆鉆約1.0～2.0 mm小孔，并穿透氣室殼膜，眼科鑷去除長方形區域內卵殼及卵殼膜。用1 mL注射器往卵殼膜與尿囊膜交接處血管較少的卵殼膜處輕輕插入并注射100 μL的無菌PBS(注射時針頭往上挑，避免刺破下方的尿囊膜)，輕輕晃動胚蛋，置于培養箱中幾分鐘后，用眼科鑷輕輕撕掉這層卵殼膜。

選擇定性濾紙，用打孔器制成直徑5 mm的圓片，雙蒸水潤濕，濕熱高壓滅菌，烘干備用。將制備好的直徑5 mm定性濾紙圓片置于CAM和卵黃囊膜外2/3血管相對較少的部位(肉眼觀)，然后用微量進樣器向濾紙分別加入終濃度為100、200、400 mg·L-1的rSVMPI(20 μL)，對照組加入等量PBS，每個濃度12個胚蛋。無菌透明膠帶封住卵窗，標記后，置37℃培養箱繼續孵育72 h。揭去封窗的透明膜，數碼相機拍照記錄結果，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0處理圖像，計數測量區(以加藥部位為中心，直徑為1 cm的圓)血管數目，計算單位面積的血管密度指數(vascular density index)，并且根據下列公式計算血管抑制率(inhibition rate,IR)。

2.3 rSVMPI對人臍靜脈內皮細胞(human umbilical veins endothelial cells, HUVECs)生物學特性的影響

2.3.1 HUVECs原代培養及鑒定[6]HUVECs來自健康剖腹產孕婦的臍靜脈。具體方法如下：臍帶剪下后，立即浸泡在4 ℃含雙抗滅菌的PBS溶液中，用含雙抗滅菌PBS溶液沖洗臍靜脈腔至液體變清亮。將37 ℃預溫的1% Ⅱ型膠原酶約12 mL注入臍靜脈腔，37 ℃孵育15 min。用約4 mL胎牛血清中止膠原酶消化作用后，再用約45 mL含雙抗滅菌的PBS溶液反復沖洗臍靜脈腔，洗液經1 200 r·min-1離心10 min，收集沉淀的HUVECs，懸浮于含20%胎牛血清、20 000 U·L-1青霉素、20 000 U·L-1鏈霉素和0.3 g·L-1谷氨酰胺的M199培養基，接種于0.2%明膠包被的培養瓶中，37℃、5% CO2培養至細胞融合后，取部分細胞爬片，用vWF抗體直接免疫標記法鑒定HUVECs細胞。細胞至80%～90%融合時，0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的M199常規傳代培養，取第3～4代對數生長期的HUVECs用于后續實驗。

2.3.2 rSVMPI對HUVECs體外生長增殖能力的影響 采用改良的AlamarBlue分析方法[7]進行檢測，將處于對數生長期的HUVECs用0.25%胰酶消化后，分別懸浮于10% FBS-RPMI 1640和10% FBS-DMEM培養液，并用血球計數板計數，將其配制為1×106·L-1濃度的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養板中，每孔100 μL，置于37℃ CO2培養箱培養，待細胞貼壁后，分別加入終濃度為(25、50、100、200、400 mg·L-1)的rSVMPI培養液，同時設立對照組，每組設5個復孔。分別在 24、48、72、96、120 h終止培養，酶標儀測定細胞在550 nm、595 nm兩波長OD值，計算細胞還原率，比較3組細胞增殖情況。每組設5個復孔。

2.3.3 rSVMPI對HUVECs體外凋亡的影響 采用Annexin V-FITC雙標記流式細胞術檢測rSVMPI誘導HUVECs早期凋亡。將處于對數生長期的HUVECs細胞制成單細胞懸液，按每孔3×105濃度接種于12孔細胞培養板常規培養，待貼壁后，分別加入終濃度為25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI，設立PBS對照組，作用24 h后，離心收集細胞，PBS洗滌離心2次，順序加入195 μL Annexin V-FITC結合液(1×) 和5 μL Annexin V-FITC，輕輕重懸細胞，輕輕混勻。室溫(20～25℃)避光孵育10 min。1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結合液(1×)輕輕重懸細胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，進行流式細胞儀檢測。每組實驗重復3次。

2.3.4 rSVMPI對HUVECs體外趨化能力的影響 根據文獻采用Boyden小室分析方法[8]進行檢測。Transwell小室置于24孔細胞培養板中，取-80°C凍存的Matrigel(8.6 g·L-1)與無血清的細胞培養液于冷EP管中以1 ∶3稀釋，混勻后，取20 μL滴加在小室聚碳酸酯膜內側。取-80℃凍存的Fibronectin(1 g·L-1)與無血清細胞培養液于冷EP管中以1 ∶1稀釋，混勻后，取20 μL滴加在小室聚碳酸酯膜外側。收集對數生長期的HUVECs細胞，PBS洗滌，重懸于分別含有終濃度為25、50、100、200、400 mg·L-1rSVMPI的1%FBS培養液中，于37 ℃、5% CO2溫育2 h后，以每孔1×105個細胞加入小室上室，下室加700 μL含10%FBS 及VEGF(終濃度為20 mg· L-1)的細胞培養液，置37 ℃、5% CO2培養24 h，取出小室，棄除上室液體，PBS洗滌，用棉簽擦盡上室膜面未穿膜的細胞及Matrigel，室溫下結晶紫染色10 min，PBS小心沖洗，200倍光鏡下計數5個視野的侵襲細胞數，取其平均值，以侵襲細胞的相對數目表示腫瘤細胞的侵襲能力，每個濃度設5個復孔。

侵襲抑制率/%=

2.3.5 劃痕標記法檢測HUVECs體外運動能力 每孔用250 μL的FN(10 mg·L-1)包被24孔培養板，每孔加入250 μL含0.1% BSA 的無血清培養液，37℃孵育1 h。將常規傳代的細胞消化洗滌后，以每孔 2×105個/500 μL的密度接種入包被好的24 孔板，細胞融合后，換成無血清培養基培養12 h，使細胞同步化。用移液器滴頭沿培養板底部呈“一”字型1 mm劃痕，鏡下記錄劃痕區相對距離，PBS輕輕洗滌2次以去除細胞碎片，無血清培養液洗滌后，更換含2%血清的培養基(實驗組分別為含25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI)，繼續培養24 h，觀察劃痕區細胞的生長情況。

2.3.6 rSVMPI對HUVECs體外血管新生能力的影響 采用管腔形成法[9](tube formation)進行檢測。在96孔培養板中每孔分別加入20 μL Matrigel(5 g·L-1)進行包被，置37℃、5%CO2孵育1 h，PBS輕輕沖洗2次，HUVECs細胞收集后以PBS洗2次，以每孔1.5×104個細胞加到已包被好的96孔培養板，融合30 min后，待細胞融合后分別加入終濃度為25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI，設立PBS對照組。常規培養細胞12、24、36 h后，分別取出96孔板，顯微鏡下觀察，200倍光鏡下每孔隨機選取5個視野并照相，計算HUVECs形成的小管樣結構(tubule-like structure, TLS)數量，采用Image Tools 3.00分析軟件進行分析。

2.3.7 rSVMPI對HUVECs細胞KDR、FGFR-1表達的影響

2.3.7.1 熒光實時定量PCR(real-time PCR)分析目的基因表達 rSVMPI(100 mg·L-1)作用于HUVECs細胞，同時設立對照組。TRIzol一步法提取不同濃度處理的各組HUVECs細胞總RNA，按照常規方法逆轉錄，采用SYBR Green法實時定量分析各組目的基因mRNA表達，以GAPDH為管家基因，采用2-ΔΔCt法計算基因表達的相對變化。各目的基因引物序列見Tab 1。

Tab 1 The primer senquence of real time PCR

2.3.7.2 免疫印跡(Western blot)驗證目的基因表達 不同組別的細胞經RIPA裂解后離心，并保留上清液，測定上清液蛋白濃度。取等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品；將蛋白電轉移至PVDF膜，進行Western blot分析，一抗及工作濃度分別是：KDR(1 ∶500)，bFGFR(1 ∶800)，以β-tubulin(1 ∶1 000)作為內參照，計算蛋白表達的相對變化。

2.4 統計學分析 應用SPSS 13.0軟件進行分析。

3 結果

3.1 SVMPI在pichia pastoris系統中的表達、純化及鑒定 純化的rSVMPI經Tris-Tricine電泳及ImageQuant TLv2003.03軟件分析，純度高達98.06%，產量為10.15 mg·L-1，分子質量約為57.9 ku，考慮所表達的目的蛋白因為糖基化所致，用EndoH糖苷酶酶切后分子質量為38 ku。而通過Vector NT I軟件計算分子質量約為36.867 2 ku，由于酵母表達載體含His和c-myc標簽(約2.5 ku)，故rSVMPI的分子質量應為二者相加，測得實際分子質量為38.754 ku，理論和實際相符合。采用免疫印跡技術鑒定GS115-SVMPI表達上清及純化的重組蛋白，結果顯示，表達上清及純化后產物均在57.9 ku處有一明顯的免疫印跡條帶，而GS115-pPICZαA培養上清泳道未出現此條帶，表明表達產物為rSVMPI。純化后的重組蛋白經聚丙烯酰胺凝膠電泳后，挖膠送質譜分析，測序結果與理論序列一致，表明經過表達、分離純化所獲得的產物為rSVMPI，EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit檢測rSVMPI，選擇有活性的重組蛋白保存在-20℃冰箱，作為后續實驗的材料。

3.2 rSVMPI對CAM血管生成的影響 為進一步評價rSVMPI對腫瘤血管生成的影響，我們選用CAM模型進行體外實驗。結果如Fig 1所示，對照組CAM血管生長良好，呈葉脈樣、放射狀分布，結構清晰，主血管粗狀，長勢旺盛。rSVMPI處理組新生毛細血管生成受到明顯抑制，血管密度降低，管徑變細，結構被破壞，呈透明或模糊樣結構，顏色變淺，血管分支多處斷開，分布零亂，而且產生視覺可見的無血管區域，未見周圍血管呈放射狀朝向濾紙生長的“血管輻輳現象”，也未發現主干血管向載體彎曲或靠近的“血管吸引現象”；rSVMPI各處理組的血管密度指數分別為(68.51±5.3)、(56.34±5.8)和(52.56±2.6)，抑制率分別為14.2%、29.4%和34.2%, 呈劑量依賴性， 與對照組(79.83±6.2)相比，差異具有統計學意義(P<0.05)。

3.3 rSVMPI對HUVECs生物學功能的影響

3.3.1 HUVECs原代培養及鑒定 分離HUVECs后進行原代培養，應用形態學結合免疫細胞化學檢測來鑒定，鏡下觀察到培養的原代細胞呈菱形或多角形，貼壁生長，匯合成片后呈鋪路石樣排列。體積大，胞質豐富，細胞排列均勻，偶見雙核。采用消化的第2代細胞，應用內皮細胞特異性vWF標記血管內皮細胞，胞質染色呈棕黃色，陽性率≥97%，證實這些細胞為HUVECs，選擇陽性的細胞用于后續實驗。

Fig 1 Effect of rSVMPI on CAM vasculargenesis(n=12)

A: CAM vasculargenesis. a: control; b: 100 mg·L-1rSVMPI; c: 200 mg·L-1rSVMPI; d: 400 mg·L-1rSVMPI. B: The vascular density index of CAM by rSVMPI treatment.*P<0.05vscontrol

3.3.2 rSVMPI對HUVECs體外生長增殖能力的影響 HUVECs分別用25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI處理不同時間后，AlamarBlue法測定吸光度。結果顯示，與對照組比較，5種不同濃度的rSVMPI處理后的HUVECs體外生長速度未見明顯改變(P>0.05)，表明rSVMPI對HUVECs細胞的體外生長無明顯影響。

3.3.3 rSVMPI對HUVECs體外凋亡的影響 HUVECs用25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI處理24 h后，采用Annexin V-FITC雙標記流式細胞術檢測HUVECs細胞早期凋亡。結果顯示，各組經rSVMPI作用后見少量凋亡細胞，但與對照組比較，差異沒有統計學意義(P>0.05)，表明rSVMPI不能誘導HUVECs凋亡。

3.3.4 rSVMPI對HUVECs體外遷移運動能力的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，劃痕后24 h處理組細胞遷移能力有所減弱，但與對照組相比，差異沒有統計學意義(P>0.05,n=5)。

3.3.5 rSVMPI對HUVECs體外趨化能力的影響 應用改良的Boyden小室檢測25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI處理24 h后，HUVECs穿越重建基底膜的細胞數，結果如Fig 2所示，5種不同濃度的rSVMPI處理后穿越重建基底膜的HUVECs細胞數目分別是(40.4±2.7)、(36.8±1.5)、(27.8±1.3)、(23.6±2.3)和(19.7±1.9)，與對照組(60.8±2.9)相比，差異有統計學意義(P<0.01)，趨化抑制率分別是33.55%、39.47%、54.28%、61.18%和 67.6%。

Fig 2 Effect of rSVMPI on HUVECs chemotaxis (×200)

A:HUVECs migrated to the bottom face of the membrane. a:control; b:25 mg·L-1rSVMPI;c:50 mg·L-1rSVMPI; d:100 mg·L-1rSVMPI; e:200 mg·L-1rSVMPI; f:400 mg·L-1rSVMPI. B:The number of cell chemotaxis by rSVMPI treatment.**P<0.01vscontrol

3.3.6 rSVMPI對HUVECs新生小管生成能力的影響 HUVECs用25、50、100、200、400 mg·L-1的rSVMPI處理不同時間后，觀察小管樣結構(TLS) 的形成情況。結果如Fig 3A所示，在包被Matrigel的培養板中，HUVECs細胞會自發生首尾相連，胞體細長，或幾個胞體環抱，末端回折形成管樣結構，或幾個細胞胞體相互連接形成管樣結構，這種類似條索樣管腔形成現象，稱為小管樣結構。 HUVECs用5種不同濃度的rSVMPI處理后，分別在12、24、36 h觀察小管樣結構的形成，可見其數量均明顯減少，與對照組相比，差異均具有統計學意義(Fig 3B)。

Fig 3 Effect of rSVMPI on TLS of HUVECs

A: TLS of HUVEC after 24 h(×200). a:control; b:25 mg·L-1rSVMPI; c：50 mg·L-1rSVMPI; d：100 mg·L-1rSVMPI; e：200 mg·L-1rSVMPI; f： 400 mg·L-1rSVMPI; B: The number of TLS after 12 h, 24 h, 36 h.*P<0.05vscontrol

3.3.7 rSVMPI對HUVECs細胞 KDR、FGFR-1表達水平的影響 鑒于KDR與FGFR-1所介導的信號轉導通路在腫瘤血管生成過程中的重要作用，本實驗采用實時定量PCR和免疫印跡技術分析rSVMPI對HUVECs細胞KDR、FGFR-1 mRNA和蛋白表達水平的影響。結果如Fig 4、5所示，rSVMPI處理組中的KDR和FGFR-1mRNA的相對表達量分別是0.605和0.804，差異具有統計學意義(P<0.05)；與對照組相比較，rSVMPI處理組中的KDR和FGFR-1的蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)，并呈劑量依賴性。這些資料表明rSVMPI可抑制HUVECs細胞KDR和FGFR-1的表達。

4 討論

腫瘤血管生成是多因素參與，多步驟的復雜過程，主要包括血管內皮細胞的增殖、遷移，細胞外基質的降解，管狀結構形成等多個環節。其中最重要的一環就是血管內皮細胞的增殖、侵襲和遷移。原代培養的HUVECs是體外研究血管生成最理想的工具，HUVECs新生小管生成能力已成為判斷血管生成的重要指標[9]。本研究結果表明，5種濃度的rSVMPI均能明顯抑制HUVECs的趨化能力和HUVECs的小管形成能力，而對HUVECs增殖和凋亡沒有影響。CAM是高度血管化的、附著于蛋殼內面、薄而透明的膜結構，在剔除其他干擾因素情況下，通過探討藥物對CAM血管生成的抑制作用，可直接證明藥物的抗血管生成功效。該方法最初由Lewis等于1931年建立，用來研究胚胎組織移植物發育的潛能。1975年，Folkman等將CAM法首先應用于腫瘤血管生成的研究，具有簡單、方便、價格便宜、觀察指標明了等優勢，是研究抗血管生成藥物經典且理想的體內實驗方法。本實驗通過CAM法探討了 rSVMPI 的抗血管生成活性，結果顯示，隨著rSVMPI劑量的不斷增加，尿囊膜新生毛細血管也相應減少，體內抗血管生成方面具有很大的潛力。本實驗室先前的研究表明，SVMPI基因轉染具有抑制B16F10血管生成擬態的能力[10]。綜上所述，這些資料證明rSVMPI具有較強的抑制腫瘤血管生成作用。

Fig 4 Effect of rSVMPI on expression levels of KDR and FGFR-1 in HUVECs by real-time PCR

A. The amplification plots and dissociation curve of real time PCR. a,b:GAPDH; c,d:KDR; e,f:FGFR-1. B:Relative expression levels of KDR and FGFR-1 in HUVECs by rSVMPI treatment.*P<0.05vscontrol

Fig 5 Immunoblot analysis of KDR and FGFR-1 in HUVECs by rSVMPI treatment

A: Immunoblot analysis of KDR and FGFR-1; B: The ratio of KDR and FGFR-1vsβ-tubulin respectively.*P<0.05vscontrol

rSVMPI抑制腫瘤血管生成的機制尚不清楚。腫瘤血管生成是腫瘤細胞與血管內皮細胞及其周圍微環境共同作用的結果。腫瘤細胞所分泌的VEGF和bFGF是2種重要的血管生成促進因子，它們同內皮細胞上的受體KDR和FGFR結合，激活內皮細胞信號傳導途徑，釋放MMPs，促進內皮細胞增殖、遷移、降解細胞外基質、侵襲基底膜，最終形成新的血管[11-13]。鑒于KDR與FGFR-1所介導的信號轉導通路在腫瘤血管生成過程中的重要作用，本實驗采用實時定量PCR和免疫印跡技術分析rSVMPI對HUVECs細胞KDR、FGFR-1 mRNA和蛋白表達水平的影響，結果顯示rSVMPI可明顯降低HUVECs細胞KDR和FGFR-1的表達水平。這些資料證明rSVMPI可能通過阻斷VEGF-KDR或bFGF-FGFR/MMPs信號轉導途徑，抑制腫瘤血管生成。

綜上所述，本研究初步證明rSVMPI可能通過阻斷VEGF-KDR或bFGF-FGFR信號轉導途徑，發揮抑制血管生成的作用，為將rSVMPI開發為抗腫瘤藥物提供了理論依據和實驗數據。

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The inhibition effects and mechanism of recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor on tumor angiogenesis

JI Ming-kai1,3,CHEN Li-hong1, CHENG Bo1,SHI Yi2,LIN Xu3, LIN Jian-yin3

(1.DeptofDermatology,theFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China;2.DeptofMolecularPathology,FujianProvincialTumorHospital,Fuzhou350014,China; 3.ResearchCenterofMolecularMedicine,KeyLaboratoryofEducationforGastrointestinalCancer,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350004,China)

Aim To investigate the effect of recombinant snake venom metalloproteinase inhibitor (rSVMPI) on neovascularization and its molecular mechanism. Methods Chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay was used to examine the antiangiogenic effect of rSVMPI. Alamar blue analysis was used to detect cell proliferation. Annexin V-FITC double labeling flow cytometry was used to assay cell apoptosis. Scratch marker was used to assay cell migration. Boyden chamber analysis method was used to detect cells chemotaxisinvitro. Tube like structure(TLS) of HUVECs was used to detect the ability of neovascularizationinvitro. Real-time PCR and Western blot were used to assay the expressions of KDR and FGFR-1 in HUVECs. Results The vascular density index (VDI) of CAM was drastically decreased after rSVMPI treatment, chemotaxis of HUVECs in response of VEGF was inhibited in the presence of rSVMPI, TLS of HUVECs was less than control group. The expressions of KDR and FGFR-1 were down-regulated by real-time PCR and Western blot assay. Conclusion rSVMPI may inhibit neovascularization by blocking the VEGF-KDR or bFGF-FGFR signal transduction pathway.

snake venom; matrix metalloproteinase; recombinant protein; expression and purification; neovascularization; signal transduction

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.040.html

2016-10-14,

2016-12-17

福建省衛生系統中青年骨干人才培養項目(No 2014-ZQN-JC-17)

紀明開(1974-)，男，博士，副教授，副主任醫師，研究方向：腫瘤分子生物學、生物工程，E-mail:mingkai_ji@163.com； 林建銀(1945-)，男，碩士，教授，博士生導師，研究方向：腫瘤分子生物學，通訊作者，Tel：0591-83569132，E-mail:jylin@mail.fjmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.020

A

1001-1978(2017)03-0394-07

R-332；R322.123；R329.24；R364.3；R977.6；R996.3