氧化槐定堿對福爾馬林致痛小鼠大腦GAT-1表達的影響

高進賢，張秀娟，余建強，蔣袁絮

(甘肅省人民醫院1.藥劑科、3.質控科，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫科大學藥學院，寧夏 銀川 750004)

氧化槐定堿對福爾馬林致痛小鼠大腦GAT-1表達的影響

高進賢1，張秀娟3，余建強2，蔣袁絮2

(甘肅省人民醫院1.藥劑科、3.質控科，甘肅 蘭州 730000；2.寧夏醫科大學藥學院，寧夏 銀川 750004)

目的 觀察小鼠大腦GABA轉運體1(GABA transporter-1,GAT-1)的變化對氧化槐定堿(oxysophoridine, OSR)鎮痛作用的影響。方法 采用福爾馬林舔足法觀察小鼠靜脈(intravenous injection，iv)給藥后OSR的鎮痛效果，免疫組織化學方法(SABC法)觀察OSR對小鼠大腦皮層和丘腦GAT-1免疫陽性細胞的影響，Real time RT-PCR方法檢測OSR對福爾馬林致痛小鼠大腦GAT-1 mRNA表達的影響。結果iv OSR 500、250、125 mg·kg-1可延長福爾馬林所致小鼠的舔足潛伏期(P<0.05，P<0.01)；腹腔注射(intraperitoneal,ip)OSR 500 mg·kg-1可使小鼠丘腦和大腦皮層的GAT-1免疫陽性細胞表達明顯減少(P<0.01)，對小鼠大腦的GAT-1 mRNA的表達也有明顯的抑制作用(P<0.05)。結論 OSR有明顯的鎮痛作用，其鎮痛作用機制與中樞GAT-1表達的下調相關。

氧化槐定堿；福爾馬林；鎮痛；GAT-1；GABA；大腦

γ-氨基丁酸(gamma aminobutyric acid，GABA)是哺乳動物中樞神經系統內主要的抑制性神經遞質，通過作用于特異的受體啟動中樞抑制作用，而GABA能神經信號突觸傳遞的強弱和時程長短主要依賴GABA轉運體(GABA transporter,GAT)的調節。GAT可快速攝取突觸間隙和細胞外液的GABA，終止GABA對突觸后膜受體的作用，研究發現GAT與疼痛、癲癇、阿爾茨海默癥(AD)、酒精的耐受性等都有密切關系[1]。

氧化槐定堿(oxysophoridine, OSR)是從豆科槐屬植物苦豆子中提取的主要生物堿，基本結構由2個3價氮原子稠和的雙哌啶環構成[2]。本實驗組前期的研究表明，OSR對多種致痛模型所致的疼痛均有明顯的緩解作用，其中鎮痛作用機制與中樞GABA、甘氨酸含量的升高和GABAA受體表達的增加有關[3]。本實驗在前期研究的基礎上，進一步探討OSR的鎮痛作用與高位中樞GAT-1的關系。

1 動物與材料

1.1 實驗動物 健康成年昆明種小白鼠，寧夏醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(寧)2005-001，SPF級，體質量18～22 g，所有小鼠給予常規飼料正常喂養。

1.2 藥品與試劑 OSR購自寧夏紫金花藥業公司，批號：071217；鹽酸嗎啡注射液(morphine,Mor)購自沈陽第一制藥廠，批號051106；兔抗鼠GAT-1多克隆抗體(批號：BA0880)、即用型SABC試劑盒(批號：SA1022)、DAB顯色試劑盒(批號：AR1022)均購自武漢博士德生物工程有限公司。TransStart Green qPCR SuperMix 試劑盒(批號：D20729)、TransZol 試劑(批號：D70811)、2×EasyTaq PCR SuperMix試劑盒(批號：D10610)、TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(批號：D20729)均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.3 儀器 低溫冰箱MDF290AT(日本Sanyo公司)；WD900G格蘭仕光波/微波爐(廣東格蘭仕集團有限公司)；LEICA RM2235切片機(德國Leica公司)；BMJ-Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺、BMJ-Ⅲ型包埋機(常州中威電子儀器廠)；OLYMPUS BH-2顯微鏡(中日合資 Olymous Optical CO. LTD)；實時定量IQ5 PCR儀、高速低溫離心機、核酸濃度測定儀( 美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 福爾馬林舔足法 小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為生理鹽水(normal saline,NS)組、Mor(20 mg·kg-1)組、OSR(500、250、125 mg·kg-1)組。Mor組ip，其余各組均iv，給藥容量為0.01 mL·g-1。給藥后60 min，在小鼠右后足跖皮下用微量注射器注射體積分數為0.02福爾馬林20 μL，觀察并記錄注射后0～5 min(第Ⅰ時相)和10～60 min(第Ⅱ時相)兩個時間段累計舔足時間，分別代表Ⅰ相和Ⅱ相的疼痛指標。

2.2 免疫組織化學法 小鼠20只，♀♂兼用，隨機分為2組：NS組和OSR組。OSR組ip OSR 500 mg·kg-1，NS組給予等容量的生理鹽水，45 min后麻醉，用100 mL體積分數為0.04的多聚甲醛灌注至動物發硬。迅速取腦，放入4℃的多聚甲醛固定液48 h，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，制成4 μm切片，60 ℃烤箱加溫2 h，用于免疫組化染色。染色后每個動物隨機取2張切片，每個切片隨機抽取2個不重疊代表性視野，在顯微鏡下觀察大腦皮質和丘腦內GAT-1免疫陽性細胞并計數。

2.3 Real time RT-PCR 小鼠30只，♀♂兼用，隨機分為3組，每組10只：福爾馬林組、正常對照組、OSR組。福爾馬林組和OSR組分別iv NS和OSR(500 mg·kg-1)，35 min后小鼠足下注射體積分數為0.02福爾馬林20 μL，60 min后取大腦(去掉小腦)于液氮中。正常對照組iv NS后于95 min取大腦(去掉小腦)于液氮中。

總RNA提取：每100 mg組織加1 mL TransZol勻漿，提取RNA。使用核酸測定儀測OA值及1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量，按TransScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明配制體系反應液，置于PCR儀中，42 ℃ 50 min，70 ℃ 15 min，將mRNA反轉錄成cDNA。

2.4 OSR對大腦GAT-1 mRNA表達的影響 采用熒光染料(SYBRgreenⅠ)實時定量PCR系統檢測GAT-1和GAPDH基因的表達水平，反應體系如下: TransStart Green qPCR SuperMixUDG(2×) 12.5 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，cDNA溶液2.5 μL，GAT-1上、下游引物分別為：5′-AACTCCTTCACCACGACC-3′和5′-TCCCAGAACTCCACCAC-3′，產物長度125 bp，退火溫度52 ℃。GAPDH上、下游引物分別為：5′-AGTCAAGGCCGAGAATGGGAAG-3′和 5′-AAGCAGTTGGTGGTGCAGGATG-3′，產物長度294 bp，退火溫度52 ℃。GAT-1和GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司設計和合成。PCR的參數為: 94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環。GAT-1和GAPDH基因同步擴增。實驗結果自動以CT值給出。相對表達量計算按照2-ΔΔCt方法進行計算。反應完畢后，將擴增的PCR產物做溶解曲線分析。

3 結果

3.1 OSR對福爾馬林致小鼠舔足潛伏期的影響 與NS組比較，Mor(20 mg·kg-1，ip)對福爾馬林所致小鼠舔足潛伏期的Ⅰ相和Ⅱ相反應均有明顯的延長作用(P<0.01)， OSR(500、250、125 mg·kg-1，iv)對Ⅰ相和Ⅱ相反應也表現出明顯的延長作用(P<0.05，P<0.01)，并隨劑量增加鎮痛作用增強；與Mor比較，OSR的抑制作用稍弱，但高劑量OSR在Ⅰ相的鎮痛效果接近于Mor，見Tab 1。

GroupDose/mg·kg-1Lickingtime/sPhaseⅠreaction(0～5min)PhaseⅡreaction(10～60min)NS-75.21±11.24179.56±17.65Mor2021.30±10.28**75.71±21.38**OSR50033.01±12.12**100.21±21.34**#25047.13±11.75*#107.87±21.23**#12565.58±17.21##143.84±23.15*##

*P<0.05,**P<0.01vsNS group;#P<0.05,##P<0.01vsMor group

3.2 OSR對小鼠大腦皮層和丘腦GAT-1免疫陽性細胞的影響 與NS組比較，ip OSR 500 mg·kg-1后小鼠大腦皮層和丘腦的GAT-1免疫陽性細胞數明顯減少(P<0.01)。陽性細胞數分別降低了59%和69%，見Tab 2、Fig 1。

GroupDose/mg·kg-1Positivecellnumber/visualfieldsCerebralcortexHypothalamusNS-169.95±6.811118.50±7.695OSR50099.85±2.280**82.10±3.598**

**P<0.01vsNS group

3.3 OSR對福爾馬林致痛小鼠大腦GAT-1 mRNA表達的影響

3.3.1 總RNA和cDNA的檢測 提取的RNA的OD值A260/280均在1.8到2.0之間，瓊脂糖凝膠電泳檢測可見3條明顯的RNA特征條帶:5S、18S、28S，反轉錄所得cDNA特異性強、質量好，熔解曲線顯示GAPDH和GAT-1定量PCR產物峰值均一、未見到其他明顯的異常波形。見Fig 2～4。

3.3.2 Real time RT-PCR結果分析 與NS組比較，福爾馬林組小鼠大腦GAT-1 mRNA的表達明顯升高，是NS的3.54倍，而OSR(500 mg·kg-1，iv ) 可明顯抑制福爾馬林誘導的GAT-1 mRNA的表達(P<0.05)，接近于NS組，見Tab 3。

Fig 1 Effect of OSR on expression of GAT-1 in cerebral cortex and hypothalamus of mice(×100)

A:Cerebral cortex of control group;B:Cerebral cortex of OSR group;C:Hypothalamus of control group;D:Hypothalamus of OSR group

Fig 2 Agarose gel electrophoresis result of total RNA in brain

Fig 3 Solubility curve of GAPDH and GAT-1

GroupDoseGAT-1mRNArelativeexpressionNS-0.39±032ΔFormalin1μL·g-11.38±0.88*OSR500mg·kg-10.46±0.56Δ

*P<0.05vsNS group;ΔP<0.05vsformalin group

Fig 4 Cumulative results of GAPDH and GAT-1

4 討論

GAT是存在于囊泡膜、突觸前膜或膠質細胞膜中Na+依賴的神經遞質轉運體，能快速重攝取突觸間隙的GABA，對GABA能神經信號突觸傳遞的強弱和時程長短有調控作用。GAT-1在脊髓和腦組織中含量豐富，占GAT總數的80%[4-5]， GAT-1作為GABA代謝系統中重要的構成部分，在痛覺信息的傳遞和調控過程中發揮重要作用。研究表明，GAT-1過表達的小鼠會出現痛覺過敏，而GAT-1敲除的小鼠明顯的對疼痛有抗傷害作用[6-7]。鞘內注射GAT-1抑制劑NO-711可明顯減輕坐骨神經結扎大鼠機械痛敏和熱痛敏[8]。另有研究表明，通過強迫游泳激活內源性阿片或非阿片依賴的下行痛覺抑制機制與阻斷GAT-1的功能有關[9]。

本實驗組前期通過扭體、熱板和熱甩尾等致痛模型研究表明OSR具有明顯的鎮痛作用[10]，鞘內注射OSR可明顯升高福爾馬林致痛小鼠脊髓和腦GABAARα1 mRNA和蛋白表達量[11]；側腦室注射OSR能增加大鼠皮層、海馬GABA免疫陽性細胞數目[12]。本實驗結果顯示，對于福爾馬林所致小鼠舔足潛伏期無論是Ⅰ相反應還是Ⅱ相反應，OSR均表現出明顯的抑制作用，提示OSR的鎮痛作用涉及中樞和外周。OSR可明顯降低小鼠大腦GAT-1免疫陽性細胞和GAT-1 mRNA表達，提示OSR的鎮痛機制與高位中樞神經系統中GAT-1下調有關。OSR通過抑制GAT-1的表達，減少GAT-1對GABA的重攝取，使神經突觸間隙GABA的相對表達量增加，增強GABA介導的中樞抑制作用，抑制痛覺信息的傳遞。OSR的鎮痛機制明顯與嗎啡不同，可能不會產生類似于嗎啡的成癮性和耐受性，因此，有關OSR更詳細的鎮痛機制及可能產生的副作用有待于進一步研究。

(致謝：本實驗在寧夏醫科大學藥學院藥理實驗室完成，感謝藥理實驗室的各位老師和同學對本實驗的大力支持。)

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Analgesic effect of oxysophoridine and its effect on brain GAT-1 in mice

GAO Jin-xian1,ZHANG Xiu-juan3,YU Jian-qiang2,JIANG Yuan-xu2

(1.DeptofPharmacy,3.DeptofMedicalQualityControl,People′sHospitalofGansuProvince,Lanzhou730000,China;2.DeptofPharmacology，NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Aim To study the analgesic effect of oxysophoridine(OSR) on GABA transporter-1(GAT-1) mRNA expression and its influence on GAT-1 expression in mice.Methods Formalin test was used to detect the analgesic effect of OSR(iv). Immunohistochemistry was taken to inspect the expression of GAT-1 in cerebral cortex and thalamus in mouse brain. The quantitative real-time PCR method was used to inspect the influence of OSR on GAT-1 mRNA expression of brain in mice.Results OSR(500,250, 125 mg·kg-1，iv) could significantly increase the foot-licking latency.OSR(500 mg·kg-1,ip) could significantly decrease the number of GAT-1 immuopositive cells in cerebral cortex and thalamus in mouse brain,and reduce GAT-1 mRNA expression in brain(P<0.01，P<0.05) in the formalin test.Conclusion OSR has a significant analgesic effect, and its analgesic mechanism is related to the GAT-1 expression in mouse brain.

oxysophoridine; formalin;analgesic;GAT-1; GABA;brain

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.044.html

2016-10-25，

2016-12-25

國家自然科學基金資助項目(No 30860372)

高進賢(1982-)，男，碩士，主管藥師，研究方向：神經藥理學，E-mail：gaojx82@163.com; 蔣袁絮(1957-)，女，碩士，教授，研究方向：神經藥理學，通訊作者,E-mail：jiangyuanxu33@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.023

A

1001-1978(2017)03-0407-05

R-332；R284.1；R322.81；R441.1；R971.1