LC-MS/MS法測定家兔血漿中鹵米松濃度及其藥動學研究

劉靜媛，武麗南，楊元輝，谷 元，魏廣力，司端運

(1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津藥物研究院釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300193)

LC-MS/MS法測定家兔血漿中鹵米松濃度及其藥動學研究

劉靜媛1,2，武麗南2，楊元輝2，谷 元2，魏廣力2，司端運2

(1.天津醫科大學研究生院，天津 300070；2.天津藥物研究院釋藥技術與藥代動力學國家重點實驗室，天津 300193)

目的 建立測定家兔血漿中鹵米松濃度的LC-MS/MS方法，研究鹵米松乳膏經皮給藥后家兔體內鹵米松的藥代動力學特征。方法 以地塞米松為內標，血漿樣品采用甲基叔丁基醚液-液萃取的處理方法，以Diamonsil C18柱(100 mm×4.6 mm,5 μm)分離，甲醇、2 mmol·L-1乙酸銨為流動相進行梯度洗脫，通過電噴霧電離源進行負離子檢測，檢測離子對為m/z503.1→413.0(鹵米松)，m/z391.0→361.0(地塞米松，內標)；以經過嚴格方法學驗證的LC-MS/MS法測定家兔單次經皮給藥(1 g/100 cm2)后血漿中鹵米松的濃度。結果 家兔血漿中鹵米松的線性范圍為0.02～20 μg·L-1，低、中、高質控濃度的批內、批間精密度(RSD)介于3.72%～7.87%之間，準確度在99.1%～103%之間。家兔單次經皮給予鹵米松乳膏后的主要藥代動力學參數Tmax、Cmax、AUC0-t、T1/2分別為：(7.38±1.06)h、(1.16±0.527)μg·L-1、(18.8±7.23)h·μg·L-1、(13.8±3.70)h。結論 該LC-MS/MS分析方法靈敏度高且樣品處理方法簡便，通過了嚴格的方法學驗證，可用于鹵米松乳膏皮膚給藥后，家兔體內鹵米松的藥代動力學研究。

鹵米松；LC-MS/MS；家兔；藥代動力學；血藥濃度；經皮給藥

皮質激素用于治療局部皮炎濕疹具有較好的效果，目前仍是臨床治療的首選藥物[1-2]。鹵米松是一種強效含鹵基的外用糖皮質類固醇藥物，0.05%鹵米松乳膏可減輕皮炎的皮膚瘙癢等臨床癥狀，在抗炎、抗毒、抗過敏和免疫抑制等方面發揮重要作用[3]。臨床研究表明，鹵米松可用于治療多種皮膚炎癥，與其他強效的皮質類固醇藥物具有同等的治療效果，具有良好的耐受性和安全性，0.05%鹵米松乳膏已經廣泛用于中國和其他東南亞國家的臨床治療[4]。

目前，鹵米松或其它糖皮質激素類含量測定的技術主要有：微分脈沖極譜法(differential pulse polarography, DPP)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)[5-7]和氣相-質譜聯用檢測法(gas chromatography-mass spectrometer, GC-MS)[8]等，但這些方法易受內源性糖皮質激素影響、靈敏度低或樣品處理過程較為復雜。秦慧[9]在研究糖皮質激素的檢測新方法中，對比傳統方法，其建立了靈敏度為0.1 μg·L-1的超聲輔助濁點萃取-HPLC檢測方法，而本文建立的LC-MS方法靈敏度更高，最低定量下限為0.02 μg·L-1，且經方法學驗證無內源性干擾。鹵米松藥代動力學的相關研究還未見報道，已經發表的文獻主要是有關于皮質類固醇藥物局部皮膚給藥后的藥理學評價[10-13]，所以建立一種快速、簡便、靈敏度高的體內鹵米松濃度測定方法，考察經皮給藥家兔后鹵米松的藥代動力學特征，對于糖皮質激素類藥物的研究以及皮膚外用藥的研究、臨床用藥和臨床評價具有重要參考價值。

本文建立的LC-MS/MS方法，色譜分離度高，特異性、靈敏度高，所用血漿樣品體積小(100 μL)，樣品處理簡便，并可用于考察0.05%鹵米松乳膏經皮給藥后家兔體內鹵米松的藥代動力學特征。

1 材料

1.1 藥品與試劑 鹵米松(純度99.6%，批號20150301)、地塞米松(純度99.1%，批號NUD150202)均由天津藥業研究院有限公司提供。鹵米松乳膏(含量0.5 mg·g-1，規格15 g，批號1406530)由中國香港澳美制藥廠生產。甲醇(色譜級，美國Fisher公司)；乙酸銨(分析級，天津市光復科技發展有限公司)；甲基叔丁基醚(色譜級，美國Tedia公司)。

1.2 儀器 Prominence 30 A液相色譜儀(日本Shimadzu公司)，配有LC-30AD二元梯度泵，SIL-30AC自動進樣器，CTO-30A柱溫箱，DGU-20A5脫氣機；Sciex TRIPLE QUADTM 5500型三重四級桿串聯質譜儀(美國Applied Biosystems公司)，配有電噴霧離子化源(ESI)及Analyst 1.5.2數據處理軟件；XS105型分析天平(瑞士METTER TOLEDO公司)；Sorvall Legend Micro 17R臺式高速冷凍離心機(Thermo Scientific公司)；樣品濃縮儀(Turbo Vap LV型，美國Caliper公司)；純水制備系統(BM-40型，北京中盛茂源科技發展有限公司)。

1.3 實驗動物 8只健康日本大耳白兔，普通級，♀♂各半，體質量2.1 kg～2.7 kg，購于北京隆安實驗動物養殖中心，生產許可證號：SCXK(京)2014-0003，動物質量合格證號：No.11401400000479。

2 方法

2.1 色譜與質譜條件 色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18柱(100 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫：40℃；流動相A：甲醇；流動相B：2 mmol·L-1乙酸銨(含5%甲醇)；梯度洗脫方案如下：0～3.5 min(30% B)→3.6～7.0 min(5% B)→7.1～10 min(30% B)，流速為0.5 mL·min-1，儀器運行時間為10 min；進樣量：10 μL。

質譜條件：離子化源：電噴霧離子化源(ESI)，負離子檢測；噴霧電壓：-4 000 V；源溫度：500℃；卷簾氣：20 psi；碰撞氣：6 psi；入口電壓：-10 V。用于定量分析鹵米松和地塞米松的離子對分別為m/z503.1→413.0(鹵米松)，碰撞能為-22 V；m/z391.0→361.0(IS：地塞米松)，碰撞能為-18 V，鹵米松和地塞米松(內標)的質譜圖見Fig 1。

2.2 標準品溶液配制 精確稱取鹵米松標準品適量，用甲醇溶解定容配制成濃度為0.1 g·L-1的儲備液。再用甲醇進一步依次稀釋成系列標準溶液，濃度為1、2.5、10、50、250、1 000 μg·L-1，質控溶液濃度為2.5、50和800 μg·L-1。

精確稱取地塞米松(內標)標準品適量，用甲醇溶解定容配制成濃度為0.1 g·L-1的儲備液。取適量上述儲備液，用甲醇稀釋為50 μg·L-1的內標工作液。

2.3 血漿校正曲線及質控樣品配制 精密吸取系列標準溶液10 μL，用空白家兔血漿按1 ∶50比例稀釋成系列血漿校正曲線樣品，血漿藥物濃度范圍為0.02～20 μg·L-1；同樣，制備血漿低、中、高濃度(0.05、1、16 μg·L-1)質控樣品。然后，按樣品處理方法處理樣品。

2.4 樣品處理方法 向100 μL含藥家兔血漿樣品中加入50 μL內標工作液(50 μg·L-1)和1 mL甲基叔丁基醚，渦旋1 min后4℃ 12 000 r·min-1離心5 min，取上清液800 μL于干凈玻璃試管，40℃氮氣吹干后殘留物用100 μL 70%甲醇-水溶液復溶，將該復溶液取出置于內插管中，4℃ 12 000 r·min-1離心10 min后，進樣10 μL進行LC-MS/MS定量分析。

2.5 方法學驗證

2.5.1 特異性 分別取6個不同來源的家兔空白血漿，除不加內標外(改加同體積甲醇溶液)，其余按“2.4”項下操作，制備空白樣品。通過比較家兔空白血漿樣品、LLOQ樣品和家兔經皮給藥后的生物樣品的色譜圖，考察本研究方法的特異性。

2.5.2 線性 按“2.4”項方法處理血漿校正曲線樣品后進樣分析。用加權最小二乘法(權重為1/χ2)，以待測物與內標物的峰面積比值(Y)和待測物濃度(X)進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為血漿校正曲線。

2.5.3 靈敏度、精密度與準確度 按“2.3”項下配制濃度為0.02、0.05、1、16 μg·L-1的靈敏度及質控血漿樣品，按“2.4”項方法處理分析，每個濃度6樣本，連續進行3個批次，應用校正曲線計算出各濃度，考察批內、批間精密度和準確度。

2.5.4 基質效應和提取回收率 對鹵米松低、中、高3個濃度進行生物樣品中基質效應和提取回收率測定，每個濃度6樣本。

取20 μL質控溶液(2.5、50、800 μg·L-1)和500 μL內標工作液混合，40℃水浴氮氣吹干后以1250 μL 70%甲醇-水溶液復溶，進樣分析記錄鹵米松和地塞米松的色譜峰面積A；取100 μL空白家兔血漿除不加內標外(改加同體積甲醇溶液)，按“2.4”項提取樣品后，用100 μL上述樣品A復溶，進樣分析記錄鹵米松和地塞米松的色譜峰面積B；按“2.3”項配制質控血漿樣品(0.05、1、16 μg·L-1)，然后按照“2.4”項操作，記錄鹵米松和地塞米松的色譜峰面積C。

色譜峰面積比B/A×100%為鹵米松和IS的基質效應；色譜峰面積比C/B×100%為鹵米松和IS的提取回收率。

2.5.5 穩定性 精密吸取低、高質控溶液(2.5、800 μg·L-1) 10 μL，用空白家兔血漿按1 ∶50比例稀釋成濃度為0.05、16 μg·L-1的穩定性血漿樣品，每個濃度6樣本。考察樣品室溫(25℃)放置24 h，-80℃循環凍融3次以及-80℃長期凍融12 d穩定性，并將按“2.4”項處理后的樣品于進樣器放置48 h，考察處理后樣品進樣器放置的穩定性。

2.6 家兔體內的藥代動力學方案 健康家兔于給藥前剃掉背部及兩側兔毛，將1 g(含鹵米松0.5 mg)鹵米松乳膏均勻涂布在家兔100 cm2(10 cm×10 cm)皮膚表面，藥物持續涂敷6 h后清洗。于給藥后1、3、6、7、9、12、15、24、48、72 h各時間點于耳緣靜脈收集血樣1 mL(肝素抗凝)，4℃ 12 000 r·min-1離心5 min收集血漿，-80℃凍存直至進行血漿樣品測定。

2.7 數據處理與藥動學參數計算 應用Analyst 1.5.2數據處理軟件，對待測物鹵米松和內標地塞米松進行積分，得出峰面積。以待測物濃度(X)為橫坐標，待測物與內標物的峰面積比值(Y)為縱坐標，用加權最小二乘法(權重為1/χ2)進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為血漿校正曲線。采用計算機軟件默認的四舍五入規則，對所有小于1 000的測定與計算數據保留3位有效數字。采用WinNonlin 6.3藥代軟件，選擇非房室模型統計矩法計算血漿藥代動力學參數。

3 結果

3.1 家兔血漿中鹵米松含量分析方法學驗證 嚴格按照化學藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則[14]，對建立的LC-MS/MS進行方法學驗證，評價方法的可行性。

3.1.2 靈敏度、精密度與準確度 鹵米松在低、中、高質控濃度批內、批間RSD值分別介于3.72%～4.95%和3.99%～7.87%，準確度在99.1%～103%之間，在LLOQ(0.02 μg·L-1)濃度下的批內、批間RSD值分別為6.40%和19.4%，準確度為94.2%，結果見Tab 1，均符合樣品分析要求。

Tab 1 Precision and accuracy of halometasonein rabbit plasma by LC-MS/MS(n=6)

3.1.3 提取回收率和基質效應 在0.05、1、16 μg·L-13個質控水平上鹵米松的提取回收率在91.8%～101%之間，基質效應范圍介于99.6%～110%之間；內標的提取回收率和基質效應分別在93.0%～100%和99.1%～105%之間。結果如Tab 2所示，鹵米松、內標提取回收率和基質效應均滿足樣品分析的要求。

Recovery/%AnalytesHalometasoneISMatrixeffect/%HalometasoneISLQC95.9±2.3996.0±3.00106±3.70104±1.18MQC92.7±0.8796.8±3.13102±1.51100±0.91HQC99.0±2.1097.0±3.21101±1.43102±0.98

Fig 2 Typical MRM chromatograms of halometasoneand dexamethasone(IS) in rabbit plasma by LC-MS/MS

A:A blank rabbit plasma sample;B:A rabbit plasma spiked with halometasone(0.02 μg·L-1) and dexamethasone(50 μg·L-1);C:A rabbit plasma sample from 15 h after dermal topical administration of 1 g/100 cm2Halometasone Cream spiked with IS

3.1.4 穩定性 按“2.5.5”項下處理制備穩定樣品，應用隨行曲線和質控樣品測得穩定性樣品的濃度，結果如Tab 3所示，鹵米松濃度為0.05、16 μg·L-1的血漿樣品室溫放置24 h、-80℃循環凍融3次、-80℃長期凍存12 d，樣品處理后進樣器放置48 h均穩定。

3.2 藥代動力學研究 實驗測定了8只健康家兔，鹵米松乳膏單次經皮給藥(1 g/100 cm2)后，72 h內血漿中鹵米松濃度。采用WinNonlin 6.3軟件，非房室模型計算藥代動力學參數，血漿樣品中鹵米松的平均藥時曲線如Fig 3所示，藥代動力學參數如Tab 4所示。

Fig 3 Mean plasma concentration-time profile of halometasoneafter dermal topical administration of 1 g/100 cm2

鹵米松乳膏經皮給藥后，家兔血漿中鹵米松的主要藥代動力學參數如下：Tmax為(7.38±1.06)h，Cmax為(1.16±0.527)μg·L-1，AUC0-t為(18.8±7.23)h·μg·L-1，T1/2為(13.8±3.70)h。

4 討論

為建立一種簡便、選擇性好、靈敏度高的LC-MS/MS方法，在本研究中進行了一系列的條件摸索與優化。選擇了響應高、特異性強的負離子掃描、多反應檢測模式，進一步優化了分子離子、碎片離子及各質譜條件；并在液相條件摸索過程中，比較不同色譜柱的色譜分離效果(如不同填料、不同柱長、不同粒徑或不同廠家)，考察不同流動相成分(甲醇、乙酸銨、水、其他緩沖液或不同比例等)和不同pH值條件的影響，確定最佳色譜柱和流動相以獲得合適保留時間，更高的色譜分離度，更高靈敏度和更好的峰型。最終，選擇Diamonsil C18柱(100 mm×4.6 mm, 5 μm)，甲醇為流動相A，2 mmol·L-1乙酸銨(含5%甲醇)為流動相B，采用梯度洗脫；同時考察合適的樣品處理方法，比較不同沉淀劑(如甲醇、乙腈)和不同提取溶劑(如乙醚、甲基叔丁基醚、正己烷)的效果，結果甲基叔丁基醚提取回收率較好，達到91.8%～101%，無內源性干擾且鹵米松受基質效應影響小。

Tab 3 Stability of halometasone under different conditions(n=6)

Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of halometasone after dermal topical administration of 1 g/100 cm2 Halometasone Cream to rabbits(n=8)

根據文獻報道[12,14-16]、FDA相關指導原則[17]，確定采用健康的日本大耳白兔為實驗動物，設定給藥部位為家兔背部，考慮脫毛劑對皮膚的刺激可能影響經皮給藥的藥物吸收，故采用給藥前電動剃須刀剃毛。依據文獻[15]，預試驗時，按0.01 g/cm2劑量給藥，則1只家兔背部涂藥面積為100 cm2(10 cm×10 cm)，藥物均勻涂抹的涂敷量為1 g，作用時間為6 h，此試驗條件下的血漿Cmax約為(1～2)μg·L-1，而要求鹵米松定量分析的檢測限為0.02 μg·L-1，且基本能夠達到LC-MS/MS方法的靈敏度要求，故設計給藥劑量為鹵米松乳膏1 g/100 cm2(即含鹵米松0.5 mg)。

根據藥物非臨床藥代動力學研究指導原則[14]要求，研究給藥后藥物進入體循環程度，設定給藥后血漿樣品采集點需包括吸收相、分布相、消除相，根據預試驗結果，設置時間點為1、3、6、7、9、12、15、24、48、72 h，實驗結果顯示家兔皮膚涂敷鹵米松乳膏(1 g/100 cm2)后，鹵米松的血漿濃度變化為7 h左右達峰，隨后血藥濃度開始下降，至給藥后72 h已下降到峰濃度的1/40以下。

乳膏劑相比較于口服制劑，可以直接作用于皮膚病灶，起效快，且用藥方便，順應性好，但其不易經皮吸收，體內血漿濃度低。本文建立的高靈敏度LC-MS/MS法成功應用于鹵米松乳膏用藥后家兔體內鹵米松藥代動力學特征的分析，且此前還未有相關報道，將有助于皮膚外用藥的研究，為臨床用藥的評價及更好的合理用藥提供研究基礎。

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Determination of halometasone and its pharmacokinetics study in rabbit plasma by LC-MS/MS

LIU Jing-yuan1,2, WU Li-nan2, YANG Yuan-hui2, GU Yuan2, WEI Guang-li2, SI Duan-yun2

(1.GraduateSchool,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China;2.StateKeyLaboratoryofDrugDeliveryTechnologyandPharmacokinetics,TianjinInstituteofPharmaceuticalResearch,Tianjin300193,China)

Aim To develop and validate a LC-MS/MS assay to quantify halometasone in rabbit plasma and study pharmacokinetics of halometasone after dermal topical administration of Halometasone Cream.Methods The plasma sample was submitted to liquid-liquid extraction using methyl tertiary butyl ether, with dexamethasone as the internal standard(IS). Chromatographic separations were performed on a Diamonsil C18column(100 mm×4.6 mm, 5 μm) with a linear gradient of methanol and 2 mmol·L-1ammonium acetate. Halometasone and dexamethasone(IS) were ionized with an ESI source operated in negative ion mode, and the detected ions werem/z503.1→413.0(halometasone),m/z391.0→361.0(dexamethasone). The test article could be monitored in rabbit plasma when following single dermal topical administration of Halometasone Cream at 1 g/100 cm2to rabbits by using a validated LC-MS/MS assay.Results Calibration curve was linear over the concentration range of 0.02～20 μg·L-1in rabbit plasma. For low, medium, high concentration of QC solutions, the intra-and inter-day precision was in the range of 3.72%～7.87%, and the accuracy was within 99.1% to 103%. The pharmacokinetic parameters in rabbits were as follows:Tmax,Cmax,AUC0-t,T1/2was (7.38±1.06)h,(1.16±0.527)μg·L-1,(18.8±7.23)h·μg·L-1,(13.8±3.70)h, respectively.Conclusions This LC-MS/MS analysis method has high sensitivity, and sample processing method is simple, which has been rigorously validated. The method could be successfully applied to the pharmacokinetic study of halometasone after skin administration of Halometasone Cream to rabbits.

halometasone;LC-MS/MS;rabbit;pharmacokinetics;plasma concentration;dermal topical administration

時間：2017-3-4 11:50

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170304.1150.046.html

2016-10-31,

2016-12-28

國家自然科學基金青年基金項目(No 81503154)

劉靜媛(1991-)，女，碩士生，研究方向：藥代動力學，E-mail: tyliujy8070@163.com; 司端運(1965-)，男，博士，研究員，研究方向：藥代動力學，通訊作者，E-mail：sidy@tjipr.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.03.023

A

1001-1978(2017)03-0411-06

R-332；R452；R969.1；R977.11