五酯膠囊對他克莫司增效作用與CYP3A5*3基因多態性的相關性研究Δ

楊 燕，辛華雯，劉 飛，熊 磊，李維亮，余愛榮（1.南方醫科大學藥學院，廣州 510515；.廣州軍區武漢總醫院臨床藥理科，武漢 430070）

五酯膠囊對他克莫司增效作用與CYP3A5*3基因多態性的相關性研究Δ

楊 燕1，2＊，辛華雯1，2#，劉 飛2，熊 磊2，李維亮2，余愛榮2（1.南方醫科大學藥學院，廣州 510515；2.廣州軍區武漢總醫院臨床藥理科，武漢 430070）

目的：探討五酯膠囊對他克莫司增效作用與細胞色素P450（CYP）3A5*3（rs776746，6986 A＞G）基因多態性的相關性。方法：選擇1997年1月－2015年12月于我院行腎移植術并于術后給予他克莫司維持治療的患者170例，根據是否聯用五酯膠囊將其分為五酯膠囊（＋）組（74例）和五酯膠囊（－）組（96例）。兩組患者均予他克莫司+嗎替麥考酚酯+潑尼松對癥治療；五酯膠囊（＋）組患者在此基礎上加服五酯膠囊，每次1粒，bid。兩組患者均連續治療≥12個月。采用化學發光微粒子免疫分析技術檢測患者用藥后0、1、3、6、12個月后他克莫司的血藥谷濃度，并計算各時間點經日劑量校正后的血藥濃度（C0/D）值；采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析法檢測患者CYP3A5*3基因多態性；采用協方差分析考察他克莫司C0/D值與基因多態性的相關性。結果：170例患者中，CYP3A5 GG、AG、AA基因型患者分別有65、83、22例，基因型頻率分別為38.2%、48.8%和12.9%，符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。五酯膠囊（＋）組GG、AG+AA基因型分布頻率與五酯膠囊（－）組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。用藥1個月時，五酯膠囊（＋）組GG基因型患者他克莫司C0/D值顯著高于五酯膠囊（－）組同基因型患者；用藥1、3、6、12個月時，五酯膠囊（＋）組AG+AA基因型患者他克莫司C0/D值顯著高于五酯膠囊（－）組同基因型患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。而用藥3、6、12個月時，兩組GG基因型患者他克莫司C0/D值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論：五酯膠囊能提高CYP3A5*3 AG+AA基因型患者他克莫司的C0/D值，而對GG基因型患者C0/D值的影響不明顯；當患者使用五酯膠囊作為他克莫司增效劑時，應考慮其CYP3A5*3基因分型。

CYP3A5*3；基因多態性；五酯膠囊；他克莫司；增效作用

他克莫司由于免疫抑制作用強、不良反應少，目前正逐漸取代環孢素，成為防治器官移植術后排斥反應的一線免疫抑制劑。但該藥需長期服用、價格昂貴，且治療窗狹窄、個體差異很大[1]。相關研究表明，五酯膠囊可明顯增加腎移植患者的他克莫司血藥濃度，從而減少使用他克莫司劑量，減輕經濟負擔，同時還可改善肝功能和減少他克莫司引起的不良反應[2-4]。他克莫司是P糖蛋白（P-gp）的底物，主要通過肝臟和腸壁的細胞色素P450（CYP）同工酶（CYP3A4和CYP3A5）代謝[5]。五酯膠囊的有效成分為木酯素衍生物，亦為CYP3A酶的底物，其對他克莫司的增效作用主要是通過CYP3A酶介導的代謝來實現[6]。CYP3A4－392A＞G對他克莫司的藥動學影響作用有限，而CYP3A5對他克莫司的藥動學影響更顯著，CYP3A5*3（rs776746，6986 A＞G）AG+AA型患者所需要的他克莫司劑量是CYP3A5*3 GG型患者的2倍[7]。五酯膠囊能否有效提高AG+AA型患者（高劑量人群）他克莫司的血藥濃度，目前尚未見深入報道。故本研究采用回顧性分析方法，初步探討五酯膠囊對他克莫司增效作用與CYP3A5*3基因多態性的相關性，以期為臨床免疫抑制劑的個體化用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇1997年1月－2015年12月在我院行腎移植術并在術后給予他克莫司維持治療的患者。納入標準：（1）器官移植術后接受他克莫司+嗎替麥考酚酯+潑尼松預防排斥反應；（2）年齡18～70歲；（3）肝功能穩定[丙氨酸轉氨酶（ALT）或天冬氨酸轉氨酶（AST）＜正常范圍上限的3倍]；（4）未聯用其他影響CYP3A酶和P-gp的藥物（如地爾硫 、酮康唑、黃連素、聯苯雙酯等）；（5）主要臨床資料完整；（6）五酯膠囊服用時間≥12個月。排除標準：（1）合并真菌感染；（2）ALT或AST超過正常范圍上限的5倍；（3）腎肌酐清除率＜20 mL/min；（4）合并嚴重的血液疾病或并發癥。本研究方案經我院醫學倫理委員會批準，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

本研究共納入患者170例，其中男性116例，女性54例，平均年齡（40.56±10.96）歲，平均體質量（60.11± 10.65）kg。根據其是否聯用五酯膠囊，分為五酯膠囊（+）組和五酯膠囊（－）組。

1.2 治療方法

五酯膠囊（－）組患者采取常規藥物對癥治療：他克莫司膠囊（愛爾蘭Astellas Pharma Co.Limited，注冊證號：國藥準字J20150101，規格：0.5 mg）0.5～4.5 mg，po，bid+嗎替麥考酚酯片（商品名：驍悉，上海羅氏制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20031277，規格：0.5 g）0.5～1 g，po，bid+醋酸潑尼松片（浙江仙琚制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H33021207，規格：5 mg）5～30 mg，po，qd；五酯膠囊（+）組患者在此基礎上加服五酯膠囊（四川禾正制藥有限責任公司，批準文號：國藥準字Z10983013，規格：每粒含五味子甲素11.25 mg）1粒，po，bid。兩組患者均連續治療≥12個月。

1.3 他克莫司血藥濃度的測定

所有患者于用藥前及調整他克莫司劑量或合并使用五酯膠囊至少1周后[8]，于次日晨起空腹抽取靜脈血5 mL。采血后3 h內，采用Architect I 1000型全自動免疫分析儀（美國Abbott公司），通過化學發光微粒子免疫分析技術檢測患者用藥0、1、3、6、12個月后他克莫司血藥谷濃度，并計算各時間點經日劑量校正后他克莫司的血藥濃度值，即血藥谷濃度/日劑量（C0/D）[（ng/mL）/（mg/d）]。

1.4 基因多態性檢測

使用Wizard DNA提取試劑盒（美國Promega Crop公司），按其說明書方法提取患者外周血DNA。采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP）法檢測其CYP3A5*3 6986 A＞G的基因多態性，具體過程參照文獻[8]，基因型準確性采用測序法驗證[9]。CYP3A5*3 PCR引物序列和產物長度見表1。

表1 CYP3A5*3 PCR引物序列和產物長度Tab 1 Primers for CYP3A5*3 PCR and length of products

1.5 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計分析。使用Kolmogorov-Smirnov檢驗進行正態性分析，符合正態分布且方差齊的采用參數方法，否則采用非參數方法。符合正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以中位數（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切性檢驗。采用χ2檢驗來評價CYP3A5*3各基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用重復測量方差分析考察他克莫司C0/D值隨時間的變化趨勢以及五酯膠囊對他克莫司C0/D值的影響；采用協方差分析考察兩組不同基因型患者他克莫司C0/D值的差異[重復測量方差分析和協方差分析均以用藥0個月時他克莫司C0/D值和紅細胞計數（RBC）作為協變量，將C0/D進行自然對數轉換成lnC0/D，經檢驗滿足正態分布和方差齊性后，進行方差分析]。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料

170例受試患者中，五酯膠囊（＋）組患者74例，其中男性51例，女性23例，平均年齡（39.21±10.91）歲；五酯膠囊（－）組患者96例，男性65例，女性31例，平均年齡（41.72±10.84）歲。兩組患者性別、年齡、體質量、體質量指數（BMI）、移植時間、血肌酐、ALT、AST和血紅蛋白水平比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；兩組患者RBC比較，差異有統計學意義（P＝0.046），詳見表2。

表2 兩組患者一般臨床資料比較Tab 2 Comparison of general clinical information between 2 groups

2.2 基因型分布

170例患者中，CYP3A5*3 6986 A＞G GG、AG、AA基因型分別為65、83、22例，基因型頻率分別為38.2%、48.8%和12.9%，符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。

χ2檢驗結果顯示，五酯膠囊（＋）組與五酯膠囊（－）組患者GG、AG+AA基因型分布比較，差異有統計學意義（P＜0.001），詳見表3。

表3 兩組患者基因型分布比較[例（%%）]Tab 3 Distribution of genotypes between 2 groups [case（%%）]

2.3 五酯膠囊對他克莫司C0/D的影響

Mann-Whitney U檢驗結果顯示，用藥0個月時五酯膠囊（+）組他克莫司C0/D值顯著高于五酯膠囊（－）組，差異有統計學意義（P＜0.05）；而其余時間點兩組患者他克莫司C0/D值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。為消除基線不平造成的影響，以患者用藥0個月時他克莫司C0/D值和RBC為協變量，進行重復測量方差分析。結果顯示，在1～12個月內，分組主效應顯著（P＜0.05），時間主效應和時間、分組的交互效應均不顯著（P＞0.05），表明五酯膠囊（+）組他克莫司C0/D值顯著高于五酯膠囊（－）組，且他克莫司C0/D值隨時間變化的趨勢不明顯，兩組之間的差異不隨時間的改變而改變，詳見表4。

表4 兩組患者不同時期他克莫司C0/D值比較[中位數（P25，P27），（ng/mL）/（mg/d）]Tab 4 Comparison of tacrolimus C0/D between 2 groups at different periods[median（P25，P27），（ng/mL）/（mg/d）]

2.4 CYP3A5*3基因多態性對五酯膠囊增效作用的影響

以用藥0個月時RBC和他克莫司C0/D為協變量，進行協方差分析。結果顯示，用藥1個月時，五酯膠囊（+）組GG基因型患者他克莫司C0/D值顯著高于五酯膠囊（－）組同基因型患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；用藥3、6、12個月時，兩組GG基因型患者他克莫司C0/D值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。用藥1、3、6、12個月時，五酯膠囊（+）組AG+AA基因型患者他克莫司C0/D值顯著高于五酯膠囊（－）組同基因型患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），詳見表5。

表5 兩組患者不同基因型、不同時期他克莫司C0/D值比較[中位數（P25，P27），（ng/mL）/（mg/d）]Tab 5 Comparison of tacrolimus C0/D among different genotypes between 2 groups at different periods[median（P25，P27），（ng/mL）/（mg/d）]

3 討論

3.1 一般臨床資料可比性

由表2可見，五酯膠囊（+）組患者的RBC明顯低于五酯膠囊（－）組，差異有統計學意義（P＜0.05），而其余指標組間比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。有研究證實，他克莫司進入人體后，83.2%的藥物與紅細胞結合[10]。五酯膠囊（+）組患者紅細胞數量少，導致其結合他克莫司的量有所減少，可能是導致用藥0個月時五酯膠囊（+）組患者他克莫司C0/D值顯著低于五酯膠囊（－）組患者的原因之一。本研究采用協方差分析和重復測量方差分析時，以患者RBC作為協變量，以盡可能消除兩組患者治療前RBC的差異對結果造成的影響。

3.2 五酯膠囊對他克莫司C0/D值的影響

本研究結果提示，五酯膠囊能有效提高他克莫司C0/D值，與已有研究結果[2]一致。采用重復測量方差分析證實了服用五酯膠囊1～12個月內，他克莫司C0/D值隨時間變化的趨勢不明顯（時間主效應P＞0.05）。已有文獻提出，CYP3A酶可將咪達唑侖（與他克莫司體內代謝特征相似）代謝為1′-羥基咪達唑侖，加用五酯膠囊后，咪達唑侖的生物利用度顯著提高，證明五酯膠囊可抑制CYP3A酶的代謝活性[2]。有研究證實，多種木酯素類（五酯膠囊的主要成分）和他克莫司都是CYP3A酶的底物，相比他克莫司，木酯素類對CYP3A酶的親和力更強，易與CYP3A酶競爭性結合，導致代謝他克莫司的CYP3A酶數量減少、他克莫司血藥濃度升高[6]。但尚無相關研究對CYP3A4和CYP3A5同工酶與五酯膠囊相互作用的強弱進行比較。

3.3 CYP3A5*3基因型對五酯膠囊與他克莫司相互作用的影響

國內有多家醫院通過檢測CYP3A5*3基因多態性來指導他克莫司的使用，高劑量人群（CYP3A5*3 AG+AA基因型患者）更需要使用他克莫司增效劑，以減少他克莫司的使用劑量。該基因型是否可以指導他克莫司和五酯膠囊聯合使用，尚未見深入報道。

CYP3A5*3 GG基因型可編碼異常的信使核糖核酸（mRNA），使CYP3A5酶不能正常表達，導致他克莫司的代謝率下降，攜帶該基因型的患者為他克莫司低劑量人群；而AG+AA基因型患者體內可產生正常的mRNA，表達出大量的功能性CYP3A5酶，使他克莫司代謝率升高，攜帶該基因型的患者為他克莫司高劑量人群[7]。為研究他克莫司不同劑量人群聯合使用五酯膠囊時是否與CYP3A5*3基因多態性相關，本研究將CYP3A5*3基因型分為GG（非表達）型和AG+AA（表達）型，就五酯膠囊對他克莫司的增效作用與基因多態性的相關性進行了較為全面的考察。為排除患者基線不齊的影響，本研究采用了協方差分析。結果顯示，當他克莫司與五酯膠囊聯合使用時，CYP3A5*3不同基因型對他克莫司C0/D值的影響有顯著性差異：CYP3A5*3 AG+AA基因型患者對五酯膠囊的增效作用更加敏感（用藥1～12個月）；而對于CYP3A5*3 GG基因型患者，五酯膠囊的增效作用并不顯著（用藥1個月）。五酯膠囊能顯著性提高CYP3A5*3 AG+AA基因型患者他克莫司C0/D值，這與最近的前瞻性研究結果[11]一致，但后者并未對CYP3A5*3 GG基因型患者進行研究。另一項研究考察了五酯膠囊對他克莫司藥動學的影響，結果顯示，五酯膠囊組CYP3A5*3 GA基因型患者他克莫司的劑量較對照組患者下降36%，但該研究未對CYP3A5*3 GG和AA基因型患者進行組間比較[12]。

CYP3A酶的代謝受到底物、抑制物、酶數量等因素的影響。相同抑制物和底物所造成的個體差異性很大程度上是由代謝酶的數量所決定的[13]。CYP3A5 AG+ AA基因型可表達出更多的CYP3A5酶[14]。五酯膠囊對AG+AA基因型患者更敏感，而對GG基因型患者無明顯影響，但目前尚未見相關研究闡明這方面機制。筆者認為，此機制可能為在CYP3A5*3表達型患者中，CYP3A5酶活性高，可被五酯膠囊競爭性抑制，使患者體內他克莫司的血藥濃度明顯升高；而在CYP3A5*3非表達型患者中，mRNA翻譯出無功能的蛋白片段，不受五酯膠囊的影響。

此外，值得注意的是，有關CYP3A5*3基因型對他克莫司藥物相互作用影響的結論并不一致：氨氯地平與他克莫司合用時，CYP3A5*3 AG+AA基因型患者他克莫司的清除率更高[15]；地爾硫與他克莫司合用時，CYP3A5*3 AG+AA基因型患者他克莫司的C0/D值更高[9]；酮康唑與他克莫司合用時，CYP3A5*3 GG基因型患者他克莫司的C0/D值更高[16]。本研究的結果并不能應用于其他影響他克莫司代謝的藥物，造成這種差異的機制仍有待進一步研究。

綜上所述，五酯膠囊能顯著提高CYP3A5*3 AG+AA型患者（他克莫司高劑量人群）他克莫司的C0/D值，而對CYP3A5*3 GG型患者的影響不明顯；當患者使用五酯膠囊作為他克莫司的增效劑時，建議考慮其CYP3A5*3基因分型。但本研究樣本量較少，有待更大樣本量、多因素分析進一步證實五酯膠囊對他克莫司的增效作用及其與CYP3A5*3基因多態性的相關性，三者間的分子機制亦需要進一步的研究予以闡明。

[1] Patel N，Cook A，Greenhalgh E，et al.Overview of extended release tacrolimus in solid organ transplantation[J]. World J Transplant，2016，6（1）：144-154.

[2] Xin HW，Li Q，Wu XC，et al.Effects of Schisandra sphenanthera extract on the blood concentration of tacrolimus in renal transplant recipients[J].Eur J Clin Pharmacol，2011，6，7（12）：1309-1311.

[3] 辛華雯，李罄，吳笑春，等.五酯膠囊與他克莫司合用對腎移植受者的成本與效果評估研究[J].中國臨床藥理學雜志，2011，27（4）：295-298.

[4] Jiang W，Wang X，Xu X，et al.Effect of Schisandra sphenanthera extract on the concentration of tacrolimus in the blood of liver transplant patients[J].Int J Clin Pharmacol Ther，2010，48（3）：224-229.

[5] Provenzani A，Santeusanio A，Mathis E，et al.Pharmacogenetic considerations for optimizing tacrolimus dosing in liver and kidney transplant patients[J].World J Gastroenterol，2013，19（48）：9156-9173.

[6] Qin XL，Chen X，Zhong G，et al.Effect of tacrolimus on

the pharmacokinetics of bioactive lignans of Wuzhi tablet（Schisandra sphenanthera extract）and the potential roles of CYP3A and P-gp[J].Phytomedicine，2014，21（5）：766-772.

[7] Staatz CE，Goodman LK，Tett SE.Effect of CYP3A and ABCB1 single nucleotide polymorphisms on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of calcineurin inhibitors：part②[J].Clin Pharmacokinet，2010，49（3）：141-175.

[8] Xin HW，Liu H，Li Y，et al.Association of CYP3A4*18B and CYP3A5*3 polymorphism with cyclosporine-related liver injury in Chinese renal transplant recipients[J].Int J Clin Pharmacol Ther，2014，52（6）：497-503.

[9] Li JL，Wang XD，Chen SY，et al.Effects of diltiazem on pharmacokinetics of tacrolimus in relation to CYP3A5 genotype status in renal recipients：from retrospective to prospective[J].Pharmacogenomics J，2011，11（4）：300-306.

[10] Zahir H，McCaughan G，Gleeson M，et al.Factors affecting variability in distribution of tacrolimus in liver transplant recipients[J].Br J Clin Pharmacol，2003，57（3）：298-309.

[11] 李嘉麗，王雪丁，王長希，等.CYP3A5*3基因型聯合五酯片干預他克莫司用藥的前瞻性研究[C]//第十二次全國臨床藥理學學術會議論文集，武漢：中國藥理學會臨床藥理專業委員會，2010：286-288.

[12] 朱蘭，王筱嘯，李娟，等.長期服用五酯膠囊減少他克莫司劑量對腎移植受者他克莫司藥動學的影響[J].中華器官移植雜志，2014，35（9）：533-536.

[13] Gibbs MA，Thummel KE，Shen DD，et al.Inhibition of cytochrome P4503A（CYP3A）in human intestinal and liver microsomes：comparison of Kivalues and impact of CYP3A5 expression[J].Drug Metab Dispos，1999，27（2）：180-187.

[14] Canaparo R，Finnstr?m N，Serpe L，et al.Expression of CYP3A isoforms and P-glycoprotein in human stomach，jejunum and ileum[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2007，34（11）：1138-1144.

[15] Zuo X，Zhou Y，Zhang B，et al.Effect of CYP3A5*3 polymorphism on pharmacokinetic drug interaction between tacrolimus and amlodipine[J].Drug Metab Pharmacokinet，2013，28（5）：398-405.

[16]Chandel N，Aggarwal PK，Minz M，et al.CYP3A5*1/*3 genotype influences the blood concentration of tacrolimus in response to metabolic inhibition by ketoconazole[J]. Pharmacogenet Genomics，2009，19（6）：458-463.

Study on the Association of Synergistic Effects of Wuzhi Capsules on Tacrolimus with CYP3A5*3 Gene Polymorphism

YANG Yan1，2，XIN Huawen1，2，LIU Fei2，XIONG Lei2，LI Weiliang2，YU Airong2（1.School of Pharmacy，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2.Dept.of Clinical Pharmacology，Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command，Wuhan 430070，China）

CYP3A5*3；Gene polymorphism；Wuzhi capsules；Tacrolimus；Synergistic effects

R968

A

1001-0408（2017）05-0581-05

2016-07-10

2016-12-21）

（編輯：張元媛）

武漢市醫院重點專學科建設及公共事業計劃項目（No.201161038346-04）

＊藥師，碩士研究生。研究方向：藥物基因組學。電話：027-50772992。E-mail：603937847@qq.com

#通信作者：主任醫師，博士生導師。研究方向：臨床藥理學、臨床藥學。電話：027-50772991。E-mail：huawenxin@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.05.02

ABSTRACTOBJECTIVE：To investigate the association of synergistic effects of Wuzhi capsules on tacrolimus with CYP3A5*3（6986A＞G，rs776746）gene polymorphisms.METHODS：One hundred and severty patients underwent renal transplantation receiving tacrolimus maintenance therapy after surgery were selected from our hospital during Jan.1997-Dec.2015，and then divided into Wuzhi capsules（+）group（74 cases）and Wuzhi capsules（－）group（96 cases）according to the use of Wuzhi capsules.Both groups received tacrolimus+mycophenolate mofetil+prednisone；Wuzhi capsules（＋）group was additionally given Wuzhi capsules，one capsule each time，bid，for more than 12 months.Trough concentration of tacrolimus was detected by CMIA 0，1，3，6，12 months after medication，and the blood concentrations（C0/D）were calculated at different time points after correcting daily dose.CYP3A5*3 gene polymorphisms was detected by PCR-RFLP.The association of C0/D value with gene polymorphism was investigated by analysis of covariance. RESULTS：Among 170 patients，there were 65 cases of CYP3A5 GG genotype，83 cases of AG genotype and 22 cases of AA genotype；genotype frequencies were 38.2%，48.8%and 12.9%，which was in line with Hardy-Weinberg balance（P＞0.05）.There was statistical significance in the distribution frequencies of GG，AG+AA genotype between Wuzhi capsules（+）group and Wuzhi capsules（－）group（P＜0.05）.After 1 month of medication，C0/D of tacrolimus in GG genotype was significantly higher in Wuzhi capsules（＋）group than in Wuzhi capsules（－）group.After 1，3，6，12 months of medication，C0/D of tacrolimus in AG+AA genotype was significantly higher in Wuzhi capsules（＋）group than in Wuzhi capsules（－）group，with statistical significance（P＜0.05）.There was no statistical significance in C0/D of tacrolimus in GG genotype between 2 groups after 3，6，12 months of treatment（P＞0.05）.CONCLUSIONS：Wuzhi capsules can increase C0/D of tacrolimus in CYP3A5*3 AG+AA genotype，but have no significant effect on C0/D of tacrolimus in GG genotype；CYP3A5*3 genotype should be considered when using Wuzhi capsules as synergist of tacrolimus.