早期胃癌中Runx-3及β-catenin蛋白的表達及臨床意義

張 聰，曹立宇，李玉潔

胃癌晚期患者預后較差，5年生存率亦較低，在疾病早期，大多數患者缺乏典型的臨床癥狀，且目前胃癌缺乏特異性的腫瘤標志物，多數患者就醫時已是晚期，因此探索新的有實際臨床意義的腫瘤標志物是目前診治胃癌的重要任務之一。Runx家族包含3個成員，分別是Runx-1、Runx-2、Runx-3,其中Runx-3為轉錄因子，可通過調節特異性的效應基因來發揮抑癌作用，并參與正常胃黏膜細胞的生長、凋亡以及分化等過程[1]。國內外多項研究結果表明，Runx-3在調節胃黏膜細胞的生長、凋亡以及分化等過程中TGF-β-catenin信號通路起著重要的中介作用。β-catenin是一種多功能糖蛋白，為環連蛋白家族成員之一[2]，可激活Wnt通路，進而在腫瘤細胞的發生、發展中起重要作用[3]。本組實驗應用免疫組化法檢測早期胃癌內鏡黏膜下剝離術(endoscopic submucosal dissection, ESD)標本中Runx-3、β-catenin蛋白的表達及臨床意義，為胃癌的早期發現和診斷探索新方法。

1 材料與方法

1.1材料收集安徽醫科大學第一附屬醫院內鏡中心于2014年1月～2015年12月之間行ESD后明確診斷為早期胃癌的標本49例，其中男性36例，女性13例，發病年齡(65.2±8.7)歲；另選取正常胃黏膜30例作為對照組。所有病例均經兩位病理專家復診并參照WHO(2012)中胃黏膜上皮性病變的診斷標準進行診斷。

1.2方法所有標本均經10%中性福爾馬林充分固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，4 μm厚連續切片，切片分別作HE及免疫組化染色。用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。實驗操作步驟按照免疫組化試劑盒說明書進行，Runx-3一抗稀釋濃度為1 ∶600，β-catenin一抗為工作液，免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋公司。免疫組化采用EnVision兩步法。

1.3結果判定Runx-3蛋白免疫組化陽性表達主要定位于細胞質及細胞核；β-catenin蛋白免疫組化陽性表達可定位于細胞膜、細胞質及細胞核內；陽性細胞呈棕黃色。采用半定量積分法進行染色結果的判讀，隨機選取10個10×40倍視野：(1)以陽性細胞所占細胞總數的比例計分：≤25%為1分，26%～50%為2分，﹥50%為3分；(2)根據陽性細胞染色的強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分。將兩項得分結果相乘：0～3分為陰性(-)，4～6分為陽性(+)。

1.4統計學處理應用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，計數資料采用χ2檢驗比較實驗各組率之間的差異；相關性分析采用Spearman法分析檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Runx-3和β-catenin蛋白在正常胃黏膜及早期胃癌組織中的表達Runx-3在正常胃黏膜組織及早期胃癌組織中的陽性率分別為86.67%(26/30)、34.69%(17/49)；Runx-3蛋白在正常胃黏膜中的表達顯著高于早期胃癌組織(P<0.05)。β-catenin蛋白在正常胃黏膜中為完整的細胞膜表達，異位表達(質/核表達)率為0(0/30)，其在早期胃癌組織中的細胞膜、細胞質、細胞核中均有表達，其異位表達率為75.51%(37/49)；β-catenin蛋白在正常胃黏膜組織及早期胃癌組織的細胞膜陽性率分別為100%(30/30)、57.14%(28/49)。β-catenin蛋白在早期胃癌組織中的異位表達率顯著高于正常胃黏膜組織(P<0.05，表1，圖1～6)。

2.2Runx-3蛋白表達與早期胃癌臨床病理特征的關系Runx-3蛋白在早期胃癌組織細胞核的表達與患者年齡、性別、腫塊直徑、浸潤深度等無關(P>0.05)，但與脈管侵犯有關(P<0.05)；Runx-3蛋白在早期胃癌組織細胞質的表達與患者年齡、性別、腫塊直徑、浸潤深度、脈管侵犯等均無關(P>0.05，表2)。

①②③④⑤⑥

圖1正常胃黏膜組織的HE染色圖2早期胃癌內鏡黏膜下剝離術組織的HE染色圖3Runx-3蛋白在早期胃癌組織中的表達(胞核陽性)，EnVision兩步法圖4Runx-3蛋白在早期胃癌組織中胞核和胞質表達缺失，EnVision兩步法圖5β-catenin蛋白在正常胃黏膜組織中的表達(胞膜陽性)，EnVision兩步法圖6β-catenin蛋白在早期胃癌內鏡黏膜下剝離術組織的細胞質/核的表達，EnVision兩步法

2.3β-catenin蛋白表達與早期胃癌臨床病理特征的關系β-catenin蛋白在早期胃癌組織細胞核、細胞質的表達與患者年齡、性別、腫塊直徑、浸潤深度、脈管侵犯等均無關(P>0.05)；β-catenin蛋白在早期胃癌組織細胞膜的表達與患者年齡、性別、腫塊直徑、浸潤深度等均無關(P>0.05)，但是與脈管侵犯有關(P<0.05，表3)。

2.4早期胃癌中Runx-3蛋白與β-catenin蛋白表達的關系Runx-3和β-catenin蛋白在早期胃癌組織中的表達經Pearson等級相關分析處理后顯示(表4)：Runx-3蛋白細胞質的表達與β-catenin蛋白細胞質的表達無關(r=0.040，P=0.778)；Runx-3蛋白細胞質的表達與β-catenin蛋白細胞核及細胞質/核的表達呈正相關(r=0.337，P=0.039；r=0.047，P=0.047)；β-catenin蛋白細胞質的表達與Runx-3蛋白細胞核及細胞質/核的表達呈負相關(r=-0.237，P=0.044；r=-0.237，P=0.044)；β-catenin蛋白細胞核的表達與Runx-3蛋白細胞質及細胞質/核的表達均無關(r=-0.023，P=0.873；r=-0.023，P=0.873)。β-catenin蛋白細胞質/核的表達與Runx-3蛋白細胞質及細胞質/核的表達均呈正相關(r=0.314，P=0.026；r=0.314，P=0.026)。

表1 Runx-3和β-catenin在正常胃黏膜及早期胃癌組織中的表達

ESD標本.內鏡黏膜下剝離術標本

表2 Runx-3表達與早期胃癌臨床病理特征的關系

*P<0.05

表3 β-catenin表達與早期胃癌臨床病理特征的關系

*P<0.05

表4 早期胃癌中Runx-3蛋白與β-catenin蛋白表達之間的關系

*P<0.05

3 討論

在哺乳動物中，Runx-1、Runx-2、Runx-3,三者之間存在廣泛的相似性，并且在轉錄和翻譯水平受到協同調控[4-6]。人們通過基因敲除等技術研究發現：Runx-1基因在胚胎造血中發揮重要作用，Runx-2基因則與閉鎖顱骨的發生、發育相關，Runx-3在神經發育、胸腺發生以及胃上皮的分化和凋亡中表現出作用[8]。近年人們發現在食管癌、結直腸癌、肝癌、甲狀腺癌及乳腺癌中存在Runx-3基因的異常表達，且與腫瘤分化、分期及預后等相關[7-11]。Chen等[11]通過免疫組化及細胞實驗等發現，食管癌中Runx-3蛋白低表達，且其低表達與臨床分期顯著相關(P<0.05)，細胞實驗發現Runx-3基因的表達可明顯抑制食管癌細胞的遷移、侵襲等，該實驗結果表明Runx-3基因可能成為食管癌的治療靶點。Lim等[12]通過臨床研究發現，Runx-3的低表達與胃癌的進展和不良預后相關，但其機制尚未完全明了，其失活和缺失是早期胃癌發生的關鍵因素，減少Runx-3的表達與生存期呈負相關，是患者不良預后的獨立預測因素，另發現，Runx-3基因恢復表達之后，胃癌細胞的生長和轉移受到明顯抑制。

β-catenin蛋白是起初被發現在細胞間黏附連接中發揮作用；除此之外，β-catenin亦是Wnt信號通路中極其重要的效應因子，在細胞的增殖及分化中起重要作用，其表達異常可導致原癌的基因激活及周期調控基因異常，與腫瘤發生、發展密切相關[13]。β-catenin蛋白可定位于細胞的不同部位，包括細胞膜、細胞質、細胞核(可單獨或同時表達)。國內外多種研究發現惡性腫瘤，如肝癌、結直腸癌、乳腺癌等，β-catenin蛋白的異常表現為β-catenin蛋白在細胞膜的表達缺失而在細胞質/核出現異常累積，多項研究[14-16]報道β-catenin蛋白表達的缺失在胃癌中是一個較為普遍的現象。金雯等[17]應用免疫組化法檢測181例結直腸癌組織中β-catenin蛋白的表達，結果發現β-catenin蛋白異位陽性率為56.9%，顯著高于正常黏膜組(P<0.05)。

本實驗通過免疫組化法觀察Runx-3、β-catenin蛋白在早期胃癌中的表達水平，結果與大多研究結果相一致，說明Runx-3及β-catenin蛋白在早期胃癌的發生和脈管侵犯中扮演重要角色，可作為早期胃癌診斷的參考指標。

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