Photoshop軟件在瘢痕病理切片膠原纖維含量定量分析中的應(yīng)用

曾倩　陳志勇　李棟梁

[摘要]目的：介紹一種瘢痕病理切片膠原纖維含量的定量分析方法。方法：應(yīng)用Photoshop軟件窗口菜單中的測量記錄工具，首先測量出病理圖像的全部面積值，再用魔術(shù)棒工具選中病理圖像中膠原纖維的區(qū)域，測量出膠原纖維所占面積值，用病理圖像膠原纖維所占面積值與全部圖像面積值之比，測量出膠原纖維的含量。結(jié)果：通過該方法能準(zhǔn)確定量測量出瘢痕病理切片中膠原纖維的含量。結(jié)論：該方法簡單、方便、直觀，值得臨床推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞]Photoshop；瘢痕；病理切片；膠原纖維；定量分析

[中圖分類號]R619.6

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1008-6455（2017）01-0093-03

瘢痕是皮膚損傷到一定程度后組織修復(fù)的必然結(jié)果。其發(fā)生的機(jī)制主要為成纖維細(xì)胞的過度增生和膠原纖維的大量沉積，準(zhǔn)確分析瘢痕病理切片中膠原纖維的含量對瘢痕的轉(zhuǎn)歸、治療效果的評價(jià)及瘢痕的進(jìn)一步研究都起著非常重要的作用。自2013年以來，筆者采用Photoshop軟件對兔耳增生性瘢痕模型病理切片中膠原纖維含量進(jìn)行定量分析，取得了滿意的效果，現(xiàn)介紹如下。

1.材料和方法

1.1材料：數(shù)碼相機(jī)（型號：Canon450D：產(chǎn)地：日本）；Photoshop軟件（版本號：Adobe PhotoshopCS4）；Masson染色兔耳瘢痕模型膠原纖維后的病理切片。

1.2方法：將Masson染色兔耳瘢痕模型膠原纖維后的病理切片統(tǒng)一用Canon450D數(shù)碼相機(jī)在同一條件下（快門速度：1/25s：曝光時(shí)間：1/30s；ISOl00；光圈：白平衡）采集圖片，將圖片導(dǎo)入計(jì)算機(jī)Adobe PhotoshopCS4軟件中，打開工具欄窗口菜單中的測量記錄工具，將導(dǎo)入軟件中的照片進(jìn)行全選，點(diǎn)擊測量記錄，這時(shí)在照片下方就會(huì)顯示出整張照片的面積測量值（如圖1），然后取消全選，恢復(fù)照片，用工具欄中的魔術(shù)棒工具選中每一個(gè)膠原纖維顯色的區(qū)域（Masson染色后兔耳瘢痕模型病理圖像中膠原纖維呈藍(lán)色），當(dāng)全部選擇完后再次點(diǎn)擊測量記錄，照片下方就會(huì)分別顯示出膠原纖維的面積測量值（如圖2），將膠原纖維的面積測量值之和/整張圖片的全部面積測量值×100%，即可得到膠原纖維的百分含量。

1.3注意事項(xiàng)：①在使用工具欄中的魔術(shù)棒工具選擇膠原纖維區(qū)域時(shí)，通常把容差設(shè)置到30左右，這樣魔術(shù)棒工具選擇膠原纖維的區(qū)域更加精確，減少測量誤差；②在選擇膠原纖維區(qū)域時(shí)，可多次用魔術(shù)棒工具選擇，直到膠原纖維的區(qū)域被全部選擇完，取多次測量面積值的總和即為膠原纖維所占的面積值；③瘢痕病理切片圖像采集時(shí)，數(shù)碼照相用固定的距離且與圖片保持垂直。

2.典型應(yīng)用

本方法應(yīng)用于《點(diǎn)陣鉺激光治療兔耳增生性瘢痕的機(jī)理研究》課題中，按李希軍等報(bào)道的方法，建立兔耳增生性瘢痕模型。選擇80個(gè)兔耳增生性瘢痕隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組各40例，實(shí)驗(yàn)組分別于上皮化后0、1、2、3月進(jìn)行點(diǎn)陣鉺激光治療（治療參數(shù)：波長2 940nm，能量50J/cm²，脈寬300um，延時(shí)2s，穿透組織深度為213um，正方形光斑，每個(gè)瘢痕重復(fù)3次），對照組不做任何處理。每次治療前兩組分別隨機(jī)切取10個(gè)瘢痕用4%多聚甲醛固定后進(jìn)行Masson染色。按本文上述方法分別對病理切片進(jìn)行照相，將照片導(dǎo)f1.AdobePhotoshopCS4進(jìn)行測量，測量結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為組間有顯著性差異，見表1。

上皮化后兔耳瘢痕膠原纖維含量隨時(shí)間逐漸升高，在2個(gè)月時(shí)達(dá)高峰，后逐漸降低，實(shí)驗(yàn)組和對照組相比，P<0.0l，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.討論

瘢痕的發(fā)生過程復(fù)雜而有序，主要表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞及其合成的細(xì)胞外基質(zhì)代謝機(jī)能失去了正常的調(diào)控，使成纖維細(xì)胞的增殖能力加強(qiáng)，凋亡減慢，引起膠原纖維過度增生，降解能力降低，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)增加，最終導(dǎo)致瘢痕形成。膠原纖維過度增生是瘢痕形成的主要物質(zhì)成分，那么，準(zhǔn)確評價(jià)膠原纖維含量的變化，將為瘢痕的療效評價(jià)、轉(zhuǎn)歸、抗瘢痕藥物的開發(fā)研制及瘢痕的進(jìn)一步研究都有著非常直觀的判斷。在以往瘢痕病理切片膠原纖維的分析方法中，大多采用光鏡下對病理切片膠原纖維排列及含量的直觀描述、網(wǎng)格計(jì)數(shù)法的測量及一些圖像分析系統(tǒng)平臺的間接分析，但這些方法都存在著主觀性較強(qiáng)、誤差較大等缺點(diǎn)，不能客觀定量地表達(dá)出膠原纖維的含量。而在Photoshop軟件處理系統(tǒng)中，窗口菜單欄中的測量記錄工具可直接顯示測量圖像的面積值，圖像經(jīng)過膠原纖維區(qū)域測量面積數(shù)據(jù)值與整個(gè)圖像測量面積數(shù)據(jù)值的比值，能客觀地用數(shù)據(jù)來量化瘢痕病理切片中膠原纖維的含量。根據(jù)數(shù)碼相機(jī)成像原理，每個(gè)電荷耦合元件感光后生成一個(gè)像素，眾多像素組成一幅照片，實(shí)際物體的成像大小與像素成正比，在不變焦的情況下與距離成反比。因此，病理切片圖像采集時(shí)，數(shù)碼照相必須用固定的距離且與圖片保持垂直。這樣分析對比的各組圖像才能保持一致性。用魔術(shù)棒工具選擇膠原纖維區(qū)域時(shí)，設(shè)置容差為30左右，容差太大或太小，魔術(shù)棒工具都不容易分辨膠原纖維區(qū)域，導(dǎo)致誤差較大。

綜上，筆者采用Photoshop軟件對兔耳瘢痕病理切片圖像中的膠原纖維進(jìn)行分析，用客觀的數(shù)據(jù)定量分析出膠原纖維在病理切片圖像中的含量。該方法簡單、準(zhǔn)確、直觀，值得推廣應(yīng)用。