過山蕨組培快繁技術(shù)研究

王旭++扶勝蘭++張景景++丁生晨++黃顯章

摘要 利用組織培養(yǎng)技術(shù)研究過山蕨種苗快繁技術(shù)體系，包括孢子囊的消毒方法、孢子萌發(fā)培養(yǎng)基、配子體增殖培養(yǎng)基以及幼孢子體誘導(dǎo)基質(zhì)，結(jié)果表明：較好的孢子囊消毒方法是70%酒精+5%次氯酸鈉組合，適合過山蕨孢子萌發(fā)和配子體生長發(fā)育的培養(yǎng)基是MS+2%蔗糖+0.7%瓊脂，pH值6.0；適合配子體增殖的培養(yǎng)基為MS+2%蔗糖+0.7%瓊脂+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，pH值6.0；適合幼孢子體誘導(dǎo)的基質(zhì)配比是草炭+細(xì)河沙（1∶1）。

關(guān)鍵詞 過山蕨；組培；快繁

中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）22-0061-02

Absrtact Using tissue culture technology to research rapid propagation technology of Camptosorus sibiricus Rupr，including the spore sac disinfection methods，spore germination medium and young sporophyte inducing matrix.The results showed that better spore sac disinfection method is 70% alcohol+0.5% NaClO combination，Suitable medium for spores germination and gametophyte growth is MS+2% sucrose+0.7% agar，pH 6.0；Suitable medium for gametophyte proliferation is MS+2% sucrose+0.7% agar+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，pH 6.0；Suitable matrix ratio for young sporophyte induced is peat + small particles river sand （1∶1）.

Key words Camptosorus sibiricus Rupr；tissue culture；rapid propagation

過山蕨（Camptosorus sibiricus Rupr）又名過橋草、馬蹬草等，為鐵角蕨科植物，以地上部分入藥，河南省伏牛山、大別山、桐柏山等山區(qū)均有分布。過山蕨性平味淡，具有活血化瘀、消炎止痛、止血、解毒等功效，民間多以其治療動脈炎癥、外傷出血、子宮出血、偏癱、下肢潰瘍、肝炎等癥。過山蕨主含三萜類、黃酮類、苯丙素類、酚酸類、有機(jī)酸類、含硫化合物、糖類、脂肪酸及其苷類等化學(xué)成分，藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤、抗氧化、擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、抗艾滋病等作用[1-2]。市場所售過山蕨多為野生，因其生長緩慢，野外繁殖率低，過度采挖造成過山蕨野生資源急劇下降，2005年被收載入《河南省重點(diǎn)保護(hù)植物名錄》。目前，過山蕨繁殖普遍采用分株法，繁殖速度較慢，遠(yuǎn)不能滿足日益增長的市場需求。因此，利用組培技術(shù)進(jìn)行過山蕨種苗的快速繁殖技術(shù)研究，是保護(hù)和利用過山蕨的必要途徑。本試驗篩選出過山蕨孢子萌發(fā)培養(yǎng)基、配子體增殖培養(yǎng)基及幼孢子體誘導(dǎo)最佳基質(zhì)配比，從而建立過山蕨種苗的快速繁殖技術(shù)體系，以便穩(wěn)定、高效生產(chǎn)過山蕨種苗，緩解野生資源壓力，滿足市場需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集河南省南陽市西峽縣太平鎮(zhèn)山區(qū)野生過山蕨植株，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材工程技術(shù)研究中心高致明教授鑒定為鐵角蕨科過山蕨（Camptosorus sibiricus Rupr），種植于南陽理工學(xué)院張仲景藥用植物園，待孢子成熟以后，采集孢子囊放入冰箱冷藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子囊的消毒。將過山蕨孢子囊用濾紙包好，消毒方法：①70%酒精。消毒15～25 s，無菌水漂洗4～5次；②5%次氯酸鈉。消毒5 min，無菌水漂洗4～5次；③0.1%升汞。消毒5～8 min，無菌水漂洗4～5次；④70%酒精+5%次氯酸鈉。先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水漂洗4～5次；⑤70%酒精+0.1%升汞。先用70%酒精消毒15～25 s，再用0.1%升汞消毒5～8 min，無菌水漂洗4～5次；⑥5%次氯酸鈉+0.1%升汞。先用5%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水漂洗4～5次，再用0.1%升汞消毒5～8 min，無菌水漂洗4～5次。消毒后的孢子囊無菌條件下接種至MS培養(yǎng)基上，每個處理接種10瓶，每瓶接種3～5個孢子囊，3次重復(fù)。30 d后，觀察孢子萌發(fā)率和污染率，篩選最佳消毒方法。

1.2.2 孢子萌發(fā)。將過山蕨孢子囊用濾紙包好，先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水漂洗4～5次，將消毒后的孢子囊無菌條件下接種至不同無機(jī)鹽含量（MS、1/2MS、1/4MS和1/8MS，蔗糖濃度2%，瓊脂0.7%，pH值6.0）和不同蔗糖濃度（MS，瓊脂0.7%，蔗糖濃度1%、2%、3%、4%，pH值6.0）的培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接種10瓶，每瓶接種3～5個孢子囊，3次重復(fù)。觀察孢子萌發(fā)時間、萌發(fā)率，60 d后觀察配子體生長情況。

1.2.3 配子體增殖。孢子萌發(fā)后形成的配子體，接種到不同生長調(diào)節(jié)劑配比的MS培養(yǎng)基上，考察不同生長調(diào)節(jié)劑配比的培養(yǎng)基對過山蕨配子體增殖的影響。植物生長調(diào)節(jié)劑選擇不同濃度6-BA（0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L）和不同濃度NAA（0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L），每種配比分別編號，每個編號接種5瓶，3次重復(fù)，接種前稱重，培養(yǎng)30 d后再取出稱重，計算增值倍數(shù)（培養(yǎng)后的重量/接種前的重量）。

1.2.4 幼孢子體誘導(dǎo)。配子體無菌條件下接種至草炭、蛭石、細(xì)河沙、草炭+蛭石（1∶1）、草炭+細(xì)河沙（1∶1）、草炭+園土（1∶1）、蛭石+細(xì)河沙（1∶1）等不同培養(yǎng)基上，考察不同基質(zhì)配比對幼孢子體誘導(dǎo)的影響。各基質(zhì)水分含量均應(yīng)滿足液面與基質(zhì)面相平，傾斜有水溢出[3-4]。

1.3 培養(yǎng)條件

各處理的培養(yǎng)條件均為空氣濕度80%，光照強(qiáng)度2 000 lx，每天光照時間12 h，溫度25 ℃[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方式對孢子萌發(fā)及污染率的影響

采用6種不同的消毒方法對過山蕨孢子囊消毒，從表1可以看出，各消毒方式對過山蕨的孢子萌發(fā)率和污染率有顯著或極顯著差異，消毒效果不同。其中，單一使用70%酒精和0.5%次氯酸鈉或者兩者配合使用，孢子萌發(fā)率較其他幾種方法較低，且污染率與其他幾種方式相比較高，但均不超過8%的經(jīng)驗污染率值，屬正常范圍內(nèi)。單獨(dú)使用0.1%升汞或與70%酒精和0.5%次氯酸鈉配合使用，污染率均較低，萌發(fā)率較高，但考慮升汞易揮發(fā)，且對人體危害較大，綜合考慮，過山蕨孢子囊的消毒方式以萌發(fā)率較高、污染率較低、消毒效果較好的70%酒精+5%次氯酸鈉組合為好。

2.2 不同培養(yǎng)基對孢子萌發(fā)的影響

2.2.1 無機(jī)鹽濃度對孢子萌發(fā)的影響。從表2可以看出，不同無機(jī)鹽濃度對孢子的萌發(fā)和配子體的生長影響較大，其中，較高的無機(jī)鹽濃度有利于孢子萌發(fā)和配子體的生長，低濃度的無機(jī)鹽不利于孢子萌發(fā)和配子體的生長，且無機(jī)鹽濃度過低如1/8MS，配子體生長勢較弱，甚至有部分萌發(fā)的配子體因營養(yǎng)不足而死亡。

2.2.2 蔗糖濃度對孢子萌發(fā)的影響。從表3可以看出，當(dāng)蔗糖濃度為4%時，孢子萌發(fā)時間晚，且萌發(fā)率低，配子體顏色枯黃，生長勢弱，這可能與高濃度蔗糖形成高滲液面從而抑制過山蕨孢子萌發(fā)和配子體的發(fā)育有關(guān)。當(dāng)蔗糖濃度為2%時，其萌發(fā)天數(shù)、萌發(fā)率、配子體顏色、配子體生長勢均占優(yōu)勢。

綜合表2、表3數(shù)據(jù)可知，有利于過山蕨孢子萌發(fā)和配子體生長發(fā)育的培養(yǎng)基是MS+2%蔗糖+瓊脂0.7%，pH值6.0。

2.3 不同生長調(diào)節(jié)劑配比對配子體增殖的影響

從表4可以看出，各個生長調(diào)節(jié)劑配比條件下配子體顏色均為翠綠，且均無幼孢子體的分化，表現(xiàn)一致，但其增殖倍數(shù)和生長勢差異較大。其總體表現(xiàn)為6-BA濃度大于NAA濃度時，配子體生長勢較強(qiáng)，增殖倍數(shù)較大，反之，則較小，而且高濃度的NAA有明顯地抑制配子體發(fā)育的趨向。結(jié)合增殖倍數(shù)與生長勢，有利于配子體增殖的生長調(diào)節(jié)劑配比為0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，培養(yǎng)基為MS+2%蔗糖+瓊脂0.7%+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，pH值6.0。

2.4 不同基質(zhì)配比對幼孢子體誘導(dǎo)的影響

由配子體增殖試驗可知，不管如何改變培養(yǎng)基，均不能誘導(dǎo)出過山蕨的孢子體，所以采用不同配比的栽培基質(zhì)進(jìn)行誘導(dǎo)，結(jié)果見表5。可以看出，不同基質(zhì)配比對過山蕨幼孢子體的誘導(dǎo)效果是不同的，從誘導(dǎo)率來看，蛭石+細(xì)河沙（1∶1）組合的誘導(dǎo)率最高，為93%，但幼孢子體的生長勢一般；細(xì)河沙、草炭+細(xì)河沙（1∶1）的誘導(dǎo)率次之，但細(xì)河沙的生長勢一般，草炭+細(xì)河沙（1∶1）的生長勢較強(qiáng)；草炭的誘導(dǎo)率最低，為41%，可能與其團(tuán)粒結(jié)構(gòu)不利于配子體上精子的游動有關(guān)。綜上所述，利于配子體誘導(dǎo)成為幼孢子體的基質(zhì)配比是草炭+細(xì)河沙（1∶1）。

3 結(jié)論與討論

利用組培技術(shù)進(jìn)行過山蕨種苗快繁，外植體的消毒至關(guān)重要，本試驗篩選出較好的孢子囊消毒方法，即先用70%酒精消毒15～25 s，再用5%次氯酸鈉消毒5 min，無菌水漂洗4～5次，但其他外植體如嫩葉、莖尖、根狀莖等的消毒方法沒有考察。

過山蕨的生長發(fā)育需經(jīng)歷2個階段，即配子體階段和孢子體階段。無機(jī)鹽濃度和蔗糖濃度對過山蕨孢子的萌發(fā)及配子體的生長發(fā)育以及不同生長調(diào)節(jié)劑配比對過山蕨配子體的增殖影響較大，本試驗篩選出利于過山蕨孢子萌發(fā)和配子體生長發(fā)育的培養(yǎng)基是MS+2%蔗糖+瓊脂0.7%，利于配子體增殖的培養(yǎng)基為MS+2%蔗糖+瓊脂0.7%+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，增殖培養(yǎng)基是否適合孢子萌發(fā)，即生長調(diào)節(jié)劑對孢子萌發(fā)是否產(chǎn)生影響，有待進(jìn)一步研究[6-8]。

過山蕨配子體的精子必須借助水才能與卵子結(jié)合，之后形成孢子體，培養(yǎng)基內(nèi)水分含量不能滿足精子的游動，所以組培瓶內(nèi)沒有幼孢子體的出現(xiàn)。不同基質(zhì)的物理性質(zhì)、蓄水能力都會影響幼孢子體的誘導(dǎo)和生長發(fā)育，本試驗篩選出一種利于配子體誘導(dǎo)成為幼孢子體的基質(zhì)配比，即草炭+細(xì)河沙（1∶1），且基質(zhì)水分含量均應(yīng)滿足液面與基質(zhì)面相平，傾斜有水溢出的要求[9-11]。

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