二甲雙胍對正常飲食大鼠血清成纖維細胞生長因子19、21及胰腺成纖維細胞生長因子受體1的影響

王 燕 孫 佩 夏 金 逄曙光，

(山東大學醫(yī)學院，山東 濟南 250013)

二甲雙胍對正常飲食大鼠血清成纖維細胞生長因子19、21及胰腺成纖維細胞生長因子受體1的影響

王 燕1孫 佩1夏 金2逄曙光1，2

(山東大學醫(yī)學院，山東 濟南 250013)

目的 探討二甲雙胍(METF)對血清成纖維細胞生長因子(FGF)19和FGF21及胰腺成纖維細胞生長因子受體(FGFR)1和Akt通路上分子的影響。方法 給予8周齡健康雄性Wistar大鼠(40只)標準飲食，隨機分為正常對照(Con)組和METF(500 mg·kg-1·d-1)。在24 w末檢測血清生化學指標及FGF19和FGF21水平。蛋白免疫印跡檢測胰腺組織FGFR1，Akt、磷酸化的Akt(p-Akt)，F(xiàn)oxO1、磷酸化的FoxO1(p-FoxO1)的表達水平。結果 METF干預可以減輕大鼠的體重，降低大鼠空腹血糖、低密度脂蛋白和膽汁酸水平。METF組大鼠血清FGF21較Con組明顯升高(P<0.05)，而FGF19較Con組明顯減低(P<0.05)。此外，胰腺FGFR1的表達水平及 Akt及FoxO1的磷酸化水平在METF干預后明顯升高(均P<0.05)。結論 METF可以降低血清FGF19、升高血清FGF21水平，對兩者產(chǎn)生相反的作用。此外，METF可能通過增加FGFR1的表達、Akt及FoxO1的磷酸化對胰腺功能產(chǎn)生影響。

二甲雙胍；成纖維細胞生長因子19；成纖維細胞生長因子21；成纖維細胞生長因子受體1

二甲雙胍(METF)主要通過活化腺苷酸活化的蛋白激酶(AMPK)，增加外周組織血糖攝取、脂肪組織脂肪酸氧化及抑制肝糖原輸出從而降低血糖〔1〕。METF能夠降低2型糖尿病患者的血糖，血糖正常的人使用也不會引起低血糖，這一優(yōu)勢使得METF在保護心血管、抗腫瘤、減肥、延長壽命等方面發(fā)揮重要作用。最新研究表明成纖維細胞生長因子(FGF)19和FGF21在糖脂代謝方面也發(fā)揮著重要作用〔2〕。FGF19與FGF21，F(xiàn)GF23同屬于β-Klotho家族，結合成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)時需要β-Klotho共受體的參與〔3〕。與其他FGFs不同，F(xiàn)GF19、FGF21產(chǎn)生后可以進入循環(huán)系統(tǒng)，通過與不同的受體結合可以活化C-Jun、Erk、Akt等通路，發(fā)揮調控糖脂代謝的作用〔4〕。FGFR1廣泛表達于脂肪組織和胰腺組織，在胰腺組織特異性表達于胰腺β細胞。胰腺FGFR1的表達失活可以導致糖尿病的發(fā)生，而特異性活化FGFR1及其介導的通路可以改善2型糖尿病的糖脂代謝〔5〕。研究證實胰十二指腸同源盒(Ipf/Pdx1)作為FGFR1的上游基因產(chǎn)物，在胰腺發(fā)育、胰島β細胞分化及胰島素分泌方面發(fā)揮著重要作用〔6〕。METF或AMPK激動劑AICAR可以增加胎鼠胰腺祖細胞的Ipf/Pdx1，使得出生后的胎鼠擁有更高的胰腺β細胞比例〔7〕。

叉頭轉錄因子(FoxO1)屬于FoxO家族，是一種主要參與細胞凋亡、應激、DNA損傷修復、腫瘤發(fā)生和糖代謝的轉錄因子，是胰島素信號通路(PI3K-AKT)上的重要轉錄因子。通常，胰島素結合胰島素受體后激活PI3K繼而使AKT磷酸化(p-AKT)，之后使FoxO1磷酸化(p-FoxO1)，磷酸化后的FoxO1可以從細胞核上解離，其細胞內定位從細胞核上轉移到細胞質中，從而失去對下游基因的調節(jié)。FoxO1在調節(jié)肝糖原輸出〔8〕、胰島素合成〔9〕、脂肪細胞分化〔10〕等方面發(fā)揮著重要作用。本研究旨在探討METF干預對血清FGF19、FGF21、胰腺FGFR1的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 從北京維通利華公司購買8周齡雄性Wistar大鼠(220～250 g，n=40)。清潔級飼養(yǎng)，室溫20℃～25℃，相對濕度55%～70%，12 h光照維持，晝夜循環(huán)。普通標準飼料(北京華阜康公司)含碳水化合物64%，脂肪6%，蛋白質23%。自由攝水、飲食，保持墊料干燥，每日定時更換，適應性喂養(yǎng)1 w后進入實驗。

1.1.2 主要試劑 鹽酸二甲雙胍(格華止)(中美上海施貴寶制藥有限公司)；FGF19抗體(70R-50760)購自美國Fitzgerald公司；FGFR1(#9740S)、Akt(#9272)、phospho-Akt (ser473，#4060)、FoxO1(#2880)、phospho-FoxO1(ser256，#9461)抗體購自美國The Cell Signaling Technology(CST)公司；抗β肌動蛋白(β-actin)抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔或者抗鼠二抗，購自中杉金橋公司。大鼠FGF19和FGF21 ELISA試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。大鼠胰島素ELISA試劑盒(Art.No.10-1250-01z)購自瑞典Mercodia 公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥方法 雄性Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后，按體重隨機分為正常對照(Con)組和METF組。METF組大鼠給予格華止(500 mg/kg/d)，連續(xù)灌胃24 w；Con組大鼠給予等量生理鹽水。兩組均給予標準飲食。藥物干預前(第1周末)內眥靜脈取血檢測兩組大鼠血清學指標。實驗終點(第24周末)收集大鼠胰島組織和血清。組織保存于液氮中，血清保存于-80℃。

1.2.2 口服糖耐量實驗(OGTT) 治療結束后，禁食16 h，行OGTT(0.2 g/kg)，即分別在葡萄糖灌胃前(0 h)，后(15，30，60，120 min)內眥靜脈采血，4℃、3 000 r/min離心20 min，分離血清，分裝后-80℃保存。

1.2.3 體重質量測定 每隔1 w相同時間測定大鼠體重。

1.2.4 血清學指標檢測 內眥靜脈取血，分離血清，檢測空腹血糖(FPG)、總膽汁酸(TBAs)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。空腹胰島素(FIN)、FGF19和FGF21水平采用ELISA法檢測。

1.2.5 蛋白免疫印跡法測胰腺組織中Akt通路相關蛋白FGFR1、Akt、FoxO1的表達 喂養(yǎng)24 w后，處死大鼠取胰腺組織，加裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上裂解組織，離心后取上清液，檢測蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后，轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂牛奶封閉1.5 h。TBST洗膜后，分別加入FGFR1、Akt、p-Akt、FoxO1、p-FoxO1一抗，4℃孵育過夜。二抗室溫孵育1.5 h，化學增強發(fā)光法(ECL)試劑盒化學發(fā)光顯影。β-actin作為內參。每個指標至少重復3～5次。

1.2.6 胰島素抵抗水平評估 胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(FPG×FIN)/22.5。

1.3 統(tǒng)計學分析 應用Graphpad軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1 兩組大鼠體重、糖、脂、膽汁酸、胰島素水平比較 第1周末，METF組大鼠體重及生化學指標與Con組比較無顯著差異。實驗期間，Con組大鼠體重持續(xù)增加，METF組大鼠體重增速較Con組減慢(圖1)。第24周末，METF可以一定程度降低大鼠的FPG(P<0.05)，但是METF組大鼠餐后0.5 h血糖與Con組比較沒有統(tǒng)計學意義。此外，METF組大鼠的FIN水平較Con組減低(P<0.05)。根據(jù)胰島素抵抗指數(shù)，METF干預可以增加胰島素敏感性。第24周末，METF組大鼠LDL-C和HDL-C均較Con組降低；與Con組大鼠比較，METF組大鼠TBAs明顯降低(P<0.05)。見表1。

圖1 兩組大鼠體重比較

生化指標第1周末Con組METF組第24周末Con組METF組體重(g)250.97±10.93256.16±9.87498.15±22.20467.7±13.861)FPG(mmol/L)5.72±0.125.73±0.155.83±0.184.81±0.40FIN(ng/ml)1.48±0.251.49±0.431.56±0.861.21±0.161)TG(mmol/L)1.28±0.371.26±0.421.43±0.441.58±0.26TC(mmol/L)2.08±0.202.12±0.162.14±0.151.87±0.12HDL-C(mmol/L)0.93±0.320.94±0.280.95±0.300.38±0.051)LDL-C(mmol/L)0.52±0.070.49±0.060.55±0.060.37±0.051)TBAs(μmol/L)30.08±4.2632.16±3.8831.83±5.1718.26±2.481)

與Con組比較：1)P<0.05

2.2 兩組大鼠血清FGF19、FGF21比較 第24周末，METF組大鼠血清FGF19水平〔(36.25±3.21)ng/ml〕較Con組〔(82.46±2.78)ng/ml〕顯著降低(P<0.05)。與血清FGF19水平一致，METF組大鼠胰腺FGF19蛋白水平明顯低于Con組(P<0.05，圖2)。與對血清FGF19的影響相反，METF組大鼠血清FGF21水平〔(837.62±58.28)ng/ml〕較Con組〔(692.55±64.16)ng/ml〕明顯升高(P<0.05)。

2.3 兩組大鼠胰腺FGFR1，Akt/PKB和FoxO1水平比較 METF組大鼠胰腺組織FGFR1較Con組明顯升高(P<0.05)，胰腺p-Akt/Akt、p-FoxO1/FoxO1水平均較Con組明顯升高(P<0.05)。見圖2。

圖2 兩組大鼠胰腺FGFR1，Akt，F(xiàn)oxO1，F(xiàn)GF19蛋白水平比較

3 討 論

METF最常用作2型糖尿病的治療，因其可以改善胰島素敏感性，抑制肝糖原輸出的作用，在多囊卵巢綜合征及肥胖癥的治療上也得到患者的認可。既往對METF作用靶點的研究主要集中在肝臟，對胰腺的研究較少。METF對血清FGF19的影響可能與血清膽汁酸的改變有關。已證實進食后食物刺激膽汁酸分泌，并在回腸中結合并活化法尼醇X受體(FXR)生成FGF19〔11〕。然而，METF活化的AMPK可以與FXR產(chǎn)生交互作用并抑制其下游基因FGF19的表達〔12〕。METF激活的AMPK與FXR的交互作用可能在不同組織中存在不同的調節(jié)方式。FGF21主要在肝臟中產(chǎn)生〔13〕，在脂肪組織和胰腺組織中也有表達。本研究發(fā)現(xiàn)METF可以提高血清FGF21水平。但是METF對FGF21影響的研究較少，且機制仍不清楚。Kim等〔14〕發(fā)現(xiàn)METF可以通過AMPK依賴的方式誘導肝臟FGF21的表達。然而，Cyphert等〔15〕認為 FXR激活后和RXR結合形成FXR/RXR復合體，結合在FGF21基因的5′末端，使肝臟產(chǎn)生FGF21。此外，通過對FGFR1的研究，發(fā)現(xiàn)METF可以明顯提高FGFR1的表達水平。這可能與Ipf/Pdx1作為FGFR1的上游基因有關。由于FGFR1在胰腺中特異性表達于β細胞，因此METF可能通過影響FGFR1的表達在β細胞生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。METF對FPG的影響可能與胰腺FoxO1的磷酸化有關。研究表明FoxO1能夠增加胰島β細胞數(shù)量，提高胰島素敏感，提升β細胞抗氧化功能〔11〕。此外，在病理情況下，F(xiàn)oxO1在減少糖脂毒性誘導的β細胞凋亡中也發(fā)揮著重要作用。一方面可以減少脂肪酸誘導的內質網(wǎng)應激，另一方面在高的血糖濃度下仍能刺激胰島素的分泌〔16〕。

然而，METF對Akt和FoxO1磷酸化的影響是否與FGF21與FGFR1的結合及活化的通路有關，還需要進一步的研究。此外，METF在肥胖或2型糖尿病大鼠模型上的應用是否會對FGFs及FGFR產(chǎn)生影響也有待進一步研究。

1 Duca FA，Cote CD，Rasmussen BA，etal.Metformin activates a duodenal Ampk-dependent pathway to lower hepatic glucose production in rats〔J〕.Nat Med，2015；21(5)：506-11.

2 付 坤，柳景華.成纖維細胞生長因子21在糖脂代謝中的研究進展〔J〕.中華老年心血管病雜志，2014；16(5)：550-3.

3 Suzuki M，Uehara Y，Motomura-Matsuzaka K，etal.Betaklotho is required for fibroblast growth factor (FGF) 21 signaling through FGF receptor (FGFR) 1c and FGFR3c〔J〕.Mol Endocrinol，2008；22(4)：1006-14.

4 Lin Z，Tian H，Lam KS，etal.Adiponectin mediates the metabolic effects of FGF21 on glucose homeostasis and insulin sensitivity in mice〔J〕.Cell Metab，2013；17(5)：779-89.

5 Hart AW，Baeza N，Apelqvist A，etal.Attenuation of FGF signalling in mouse beta-cells leads to diabetes〔J〕.Nature，2000；408(6814)：864-8.

6 Rutter GA，Pullen TJ，Hodson DJ，etal.Pancreatic beta-cell identity，glucose sensing and the control of insulin secretion〔J〕.Biochem J，2015；466(2)：203-18.

7 Gregg B，Elghazi L，Alejandro EU，etal.Exposure of mouse embryonic pancreas to metformin enhances the number of pancreatic progenitors〔J〕.Diabetologia，2014；57(12)：2566-75.

8 Titchenell PM，Chu Q，Monks BR，etal.Hepatic insulin signalling is dispensable for suppression of glucose output by insulin in vivo〔J〕.Nat Commun，2015；6：7078.

9 Zhang T，Kim DH，Xiao X，etal.FoxO1 plays an important role in regulating beta-cell compensation for insulin resistance in male mice〔J〕.Endocrinology，2016；157(3):1055-70.

10 Zou P，Liu L，Zheng L，etal.Targeting FoxO1 with AS1842856 suppresses adipogenesis〔J〕.Cell Cycle，2014；13：3759-67.

11 Rysz J，Gluba-Brzozka A，Mikhailidis DP，etal.Fibroblast growth factor 19-targeted therapies for the treatment of metabolic disease〔J〕.Exp Opin Invest Drugs，2015；24(5)：603-10.

12 Lien F，Berthier A，Bouchaert E，etal.Metformin interferes with bile acid homeostasis through AMPK-FXR crosstalk〔J〕.J Clin Invest，2014；124(3)：1037-51.

13 Nishimura T，Nakatake Y，Konishi M，etal.Identification of a novel FGF，F(xiàn)GF-21，preferentially expressed in the liver〔J〕.Biochim Biophys Acta，2000；1492(1)：203-6.

14 Kim EK，Lee SH，Jhun JY，etal.Metformin prevents fatty liver and improves balance of white/brown adipose in an obesity mouse model by inducing FGF21〔J〕.Mediators Inflamm，2016；2016：5813030.

15 Cyphert HA，Ge X，Kohan AB，etal.Activation of the farnesoid X receptor induces hepatic expression and secretion of fibroblast growth factor 21〔J〕.J Biol Chem，2012；287(30)：25123-38.

16 Shao S，Yang Y，Yuan G，etal.Signaling molecules involved in lipid-induced pancreatic beta-cell dysfunction〔J〕.DNA Cell Biol，2013；32(2)：41-9.

〔2016-07-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Effects of metformin on FGF19 and FGF21 and pancreatic FGFR1 in normal diet male rats

WANG Yan,SUN Pei,XIA Jin,etal.

Shandong University School of Medicine,Jinan 250013,Shandong,China

Objective To examine metformin's effects on FGF19 and FGF21 serum levels as well as pancreatic FGFR1 protein levels.Methods 40 male Wistar rats were randomly assigned to control group (Con) and metfromin group (METF) with or without metformin treatment (500 mg·kg-1·d-1).Biochemical parameters and serum FGF19 and FGF21 levels were evaluated after 24 weeks intervention.Pancreatic tissues were collected to assess FGFR1,Akt and FoxO1 protein levels by Western blot.Results Metformin reduced body weight,fasting plasma glucose (FPG),low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and total bile acids (TBAs) levels compared to those of Con group.Besides,serum FGF21 level was higher and FGF19 level was lower in METF rats. Moreover,protein levels of pancreatic FGFR1,phosphorylated Akt (p-Akt) and phosphorylated-FoxO1 (p-FoxO1) were significantly increased in METF rats.Conclusions Metformin might have an impact on beta cells by increasing protein levels of FGFR1,p-Akt and p-FoxO1.

Metformin;FGF19;FGF21;FGFR1

國家自然科學基金(81170771)；山東省科技發(fā)展計劃(2012GSF11803);山東省重點研發(fā)項目(2016GSF201019)；濟南市國際合作項目(201011008)

逄曙光(1966-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事糖尿病和膽汁酸代謝的基礎和臨床研究。

王 燕(1989-)，女，在讀碩士，主要從事糖尿病和膽汁酸代謝的基礎及臨床研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)04-0817-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.04.014

1 山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院內分泌科

2 泰山醫(yī)學院