維甲酸對腦出血大鼠LINGO—1表達的影響

梁順利　吳憂　張榮博　章水晶　徐彬

[摘要]目的 觀察腦出血后LINGO-1表達的變化，探討維甲酸對腦出血后LINGO-1表達的影響。方法 將72只SD大鼠隨機分為假手術組，模型組和維甲酸治療組，選取造模后1d，3d，7d和14d為觀察點。制備腦出血模型，Longa評分法評價神經功能缺損程度，RT-PCR法檢測LINGO-1 mRNA的表達，Western blot法檢測LINGO-1蛋白的表達。結果 模型組Longa 評分7d最高，14d出現下降；LONG-1 mRNA 3d表達最高，7～14d出現下降；LONG-1蛋白7d到高峰，14d出現下降。維甲酸治療組在14d Longa評分較模型組下降（P<0.05）；在7d和14d LINGO-1mRNA表達較模型組下降（P<0.05）；在14d LINGO-1蛋白表達較模型組下降（P<0.05）。結論 腦出血后LINGO-1表達明顯上調，呈先上升后下降的變化規律。維甲酸可以降低LINGO-1 mRNA和蛋白的表達及神經功能評分。

[關鍵詞] 含亮氨酸重復序列和免疫球蛋白結構域的勿動蛋白受體作用蛋白；腦出血；維甲酸；神經再生

中圖分類號：R743.3 文獻標識碼：A 文章編號：1009-816X

[Abstract] Objective To explore the effect of retinoic acid on expressions of LINGO-1 in rats after intracerebral hemorrhage （ICH）. Methods 72 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， and retinoic acid group. Observation was made at 1，3，7，14d after ICH. Neurological functional recovery was evaluated by Longas score； RT-PCR and Western blot were applied to detect the changes in the expressions of LINGO-1 mRNA and protein. Results Longas score and LINGO-1 protein were decreased at 14d after ICH in retinoic acid group compared with those in model group（P<0.05）。 The LINGO-1 mRNA was decreased at 7d and 14d after ICH in retinoic acid group compared with model group（P<0.05）. Conclusions The decreased expressions of LINGO-1 and neurological score induced by retinoic acid might be one of the mechanisms of neural function recovery after ICH.

[Key words] LINGO-1； Intracerebral hemorrhage； Retinoic acid； Nerve regeneration

腦出血（Intracerebral hemorrhage， ICH）是一種常見的神經系統疾病，最終導致持久的功能損害，其原因為中樞神經損傷后再生能力的缺乏。近年研究發現勿動蛋白（Nogo）與神經再生障礙有關，抑制Nogo或受體復合物可以促進軸突的生長[1]。含亮氨酸重復序列和免疫球蛋白結構域的Nogo受體作用蛋白（Leucine rich repeat and Ig domain containing， Nogo receptor interacting protein， LINGO-1）是Nogo受體復合物中的一種重要的跨膜蛋白，負向調節少突膠質細胞分化，軸突再生， 髓鞘形成和神經元存活[3]。研究表明抑制LINGO-1的表達能延長神經軸突和改善神經功能。維 甲酸（retinoic acid，RA） 是脂溶性維生素A的衍生物，在缺血性卒中和脊髓損傷的研究中能抑制LINGO-1的表達，促進神經功能恢復，但LINGO-1在ICH方面的研究甚少。本研究觀察RA對ICH后LINGO-1表達的影響，旨在探討LINGO-1在ICH中的可能作用及維甲酸對ICH的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和分組：清潔級雄性成年SD大鼠72只，體重180-220g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。隨機分三組，即假手術組（n=24），模型組（n=24）和RA治療組（n=24）。

每組又分為術后1d，3d，7d，14d四個小組，每小組各6只。

大鼠腦出血模型制備： 參照Yang[4]報1.2 道的方法：術前4 h禁食不禁水，稱重后用10%

水合氯醛按350mg/kg腹腔麻醉，俯仰立體定向儀上并固定，用微量注射器從大鼠近尾段的尾動脈抽取50？l新鮮不凝血，在立體定向儀引導下按20？l/min的速度緩慢勻速緩慢注入左側尾狀核（前囟前0.2mm，左側中線旁開3mm，深度5mm）。注血結束后留針15min等血液凝固后慢慢拔針，保溫至蘇醒后分籠喂養。假手術組在相同部位緩慢注入50？l生理鹽水，其余步驟同上。RA治療組RA用二甲基亞砜溶解成濃度為3mg/ml的溶液，于造模成功后腹腔注射，每只大鼠每天10mg/kg，連用14d；模型組每只大鼠每天3.3ml/kg的生理鹽水腹腔注射；假手術組術后不做任何處理。

1.3 LINGO-1 mRNA檢測： 采用RT-PCR法檢測：腦組織取自出血灶周，所得RNA用紫外線分光光度計定量測量RNA濃度。逆轉錄合成cDNA：反應體積10μl，37 ℃孵育15 min，85 ℃，5 s 終止反應，滅活反轉錄酶。引物序列如下：LINGO-1 引物序列為上游5-GCCACCTGGTCTATCT CCGTTTC-3，下游5-GCAGGTAATTGAGCCCACGAAA G-3（162 bp）。內參ACTIN 上游5-CG TTGACATCCGTAAAGACCTC-3，下游5-TAGGAGC CAGGGCAGTAATCT -3（110 bp），均由武漢谷歌生物有限公司設計合成。反應條件：94 ℃預變性3 min，進入循環94 ℃變性30s，58 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，35 個循環，最后72 ℃延伸5min。RT-PCR 產物在瓊脂糖凝膠上進行電泳，電泳條帶用美國Quantity-one凝膠圖像處理系統分析，計算目的條帶和內參照吸光度比值。

1.4 LINGO-1蛋白檢測：采用Western blot法檢測 ：出血灶周腦組織在PBS中勻漿，離心，加入裂解液后置于冰上不斷攪拌，后于4 ℃離心8 min，上清液用3倍緩沖液稀釋，100℃煮5min制樣，用于SDS-PAGE。將膠上的蛋白轉移到PVDF膜，用1% 酪蛋白封閉液封閉膜1h，在0.5%封閉液稀釋的一抗中4℃過夜。洗膜后在HRP標記的二抗搖床孵育2h，漂洗后在化學發光溶液中顯色，用ChemiDoc XPS 系統掃描，用Image Lab 4.0圖像軟件測量LINGO-1蛋白和β-actin 蛋白各顯色條帶的平均光密度比值。

1.5 神經功能評分：參考 Longa[5]評分標準，在造模成功后1d，3d、7d、14d分別對各組大鼠進行神經功能評分。0 分：無神經缺損癥狀。1 分：提尾懸空時對側前肢呈屈曲，不能完全伸展。2 分：行走時向對側轉圈。3 分：站立時向對側傾倒。4 分：不能自行行走，意識下降。0分和4分大鼠不納入模型組和RA治療組，假手術組評分不限。當大鼠數量減少時再按隨機方法予以補足每組大鼠數。

1.6 統計學處理：用SPSS18.0版軟件統計分析，數據用均數±標準差（（）表示，統計方法用單因素方差分析，組組比較方差齊者用LSD法，RA治療組各時間點對LINGO-1蛋白表達與Longa評分進行Pearson相關性分析， P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能Longa評分：假手術組Longa評分均低，各時間點比較無統計學差異（P>0.05）；模型組與假手術組比較，各時間點Longa評分均增高，均有統計學差異（P<0.05），且7d時間點表達量最高，14d出現下降；RA治療組與模型組比較，在1d，3d，7d時間點，Longa評分差異無統計學意義（P>0.05），在14d時間點，Longa評分下降明顯，差異有統計學意義（P<0.05），提示14天RA治療組較模型組神經功能恢復程度較好，見表1。

2.2 LINGO-1 mRNA：表達變化：假手術組LINGO-1 mRNA僅少量表達，各時間點比較無統計學差異（P>0.05）；模型組1d，3d，7d及14d LINGO-1 mRNA 表達與假手術組相比均明顯升高（P<0.05），3d 時間點表達最高，7d至14d 表達呈下降趨勢；RA治療組LINGO-1 mRNA表達，在1d和3d時間點與模型組比較無統計學差異（P>0.05），在7d和14d 時間點較模型組降低，有統計學差異（P<0.05），見表2。

2.3 LINGO-1蛋白表達變化：假手術組LINGO-1蛋白表達量少，各時間點比較無統計學差異（P>0.05）；模型組1d，3d，7d及14d LINGO-1蛋白表達與假手術組相比均明顯升高（P<0.05），且在7d達高峰，14d出現下降；RA治療組LINGO-1蛋白表達，在1d和3d時間點與模型組比較無統計學差異（P>0.05），在7d和14d 時間點較模型組降低，有統計學差異（P<0.05），見表3。

3 討論

ICH是臨床常見腦血管病，致死致殘率高。中樞系統損傷導致神經軸突不能再生，最終遺留神經功能障礙。而神經軸突的再生與髓鞘相關抑制因子有關。研究表明[6]：髓鞘相關抑制因子與勿動蛋白受體（Nogo receptor， NgR）復合物相結合，激活RhoA激酶，使細胞骨架發生動力學改變，進而引起神經軸突的生長錐潰變，從而抑制軸突再生和延長。進一步研究表明[7]：LINGO-1是連接髓鞘抑制信號與NgR復合物的紐帶。LINGO-1為中樞神經系統（Central Nervous System，CNS）專有蛋白，高度表達于CNS神經元和少突膠質細胞。LINGO -1的主要功能有以下幾個方面[8]：（1）抑制軸突再生；（2）抑制少突膠質細胞分化和髓鞘形成；（3）抑制神經元存活。在缺血性卒中LINGO-1表達上調，而在出血性卒中，LINGO-1表達是否上調仍不清楚。本研究結果顯示ICH后LINGO-1 mRNA表達于1d開始增加，3d 到達高峰，7d開始下降，14 d 進一步下降。3d前的上升考慮為出血性腦損傷后神經元的應激反應及炎性因子的刺激所致，7d～14d下降考慮為血腫的吸收期，應激和炎性因子刺激減少，LINGO -1 mRNA相應降低。相對應的LINGO-1 蛋白表達于1d開始增加，7d到達高峰，14d的逐漸下降。簡而言之，在出血周邊區，LINGO-1的表達隨血腫的出現上升，隨血腫的吸收出現下降，但仍高于假手術組。推測ICH早期特別是3d-7d LINGO-1高水平維持可能是ICH后神經再生障礙的原因之一。

RA是脂溶性維生素A的衍生物，是核受體中維甲酸受體（RAR）的配體，并能通過血腦屏障到達受損的神經細胞產生效應。Puttagunta等[9]研究證實RA-RAR通路與NgR復合體通路在神經軸突再生和延長的直接關系。CNS受損后，RA和RAR結合，再與LINGO-1啟動子上的維甲酸反應成分（ RARE） 結合，抑制LINGO-1表達，促進神經軸突生長，起到改善神經功能的作用[9]。在脊髓損傷和缺血性卒中的研究中使用RA治療，均能抑制LINGO-1的表達，促進神經軸突的生長和神經功能的恢復[10，11]。本研究結果顯示：與模型組比較，RA治療組神經功能Longa評分在14d出現明顯下降，LINGO-1 mRNA的表達在7d和14d出現明顯下降，LINGO-1蛋白的表達亦在14d出現明顯下降，且LINGO-1蛋白水平與Longa評分行相關性分析示兩者強相關。提示RA治療作用可能是通過抑制了LINGO-1mRNA和蛋白的表達，抑制RhoA激活，減少RhoA激酶的活化，促進腦出血周圍神經軸突的再生和延長，進而促進神經功能的改善，為RA在ICH中的應用提供了依據。

參 考 文 獻

[1]Wang Y， Gu J， Feng X， Wang H， et al. Effects of Nogo-A receptor antagonist on the regulation of Wnt signaling pathway and neural cell proliferation in newborn rats with hypoxic ischemic encephalopathy [J]. Mol Med Rep， 2013，8（3）：883-886.

[2]Zhao RR， Andrews MR， Wang D， et al. Combination treatment with anti-Nogo-A and chondroitinase ABC is more effective than single treatment at enhancing functional recovery after spinal cord injury [J]. Eur J Neurosci， 2013，38（6）：2946- 2961.

[3]Andrews JL， Femandez-Enright F. A decade from discovery to therapy：Lingo-1， the dark horse in neurological and psychiatric disorders [J]. Neurosci Biobehav Rev， 2015，56（9）：97-114.

[4]Yang GY， Betz AL， Chenevert TL， et al. Experimental intracerebral hemorrhage relationship between brain edema， blood flow and blood brain barrier permeability in rats [J]. J Neurosurg， 1994，81（1）：93-102.

[5]Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke， 1989， 20（1） ： 84 -91.

[6]Kempf A， Schwab ME. Nogo-A represses anatomical and synaptic plasticity in the central nervous system [J]. Physiology， 2013， 28（3）： 151 - 63.

[7]Cen J， Wu H， Wang J， et al. Local injection of lentivirus encoding LINGO-1-sh RNA promotes functional recovery in rats with complete spinal cord transaction [J]. Spine， 2013， 38（19）： 1632 - 1639.

[8]Zhang Y， Zhang YP， Pepinsky B， et al. Inhibition of LINGO-1 promotes functional recovery after experimental spinal cord demyelination [J]. Exp Neurol， 2015， 266（4）：68-73.

[9]Puttagunta R， Schmandke A， Floriddia E， et al. RA-RAR-beta counteracts myelin-dependent inhibition of neurite outgrowth via Lingo-1 repression [J]. J Cell Biol， 2011， 193（7）：1147-1156.

[10]孟二艷，邢宏義。腦缺血后LINGO-1表達的動態變化及維甲酸對LINGO-1表達的影響[J]。中風與神經疾病雜志，2014，31（8）：684-686.

[11]Ji B， Li M， Wu WT， et al. LINGO-1 antagonist promotes functional recovery and axonal sprouting after spinal cord injury [J]. Mol Cell Nerosci， 2006，33（3）：311-320.