FSH體外干預小鼠卵巢后DGE表達譜的建立及初步分析

馬春驥，張曉光，裴秀英，王燕蓉

(1.寧夏職業技術學院生物與制藥技術系,寧夏銀川 750021；2.寧夏醫學科學研究所,寧夏銀川 750004；3.河南省漯河市醫學高等專科學校第二附屬醫院，河南漯河 462300；4.寧夏醫科大學生育力保持教育部重點實驗室，寧夏銀川 750004)

FSH體外干預小鼠卵巢后DGE表達譜的建立及初步分析

馬春驥1，2，張曉光3，裴秀英2，4，王燕蓉4

(1.寧夏職業技術學院生物與制藥技術系,寧夏銀川 750021；2.寧夏醫學科學研究所,寧夏銀川 750004；3.河南省漯河市醫學高等專科學校第二附屬醫院，河南漯河 462300；4.寧夏醫科大學生育力保持教育部重點實驗室，寧夏銀川 750004)

本研究利用數字基因表達譜技術，構建FSH體外干預小鼠卵巢12 h后的DGE差異基因表達譜，并對差異表達基因進行GO功能和Pathway信號通路分析。發現FSH干預培養12 h組(FA)和無FSH干預培養12 h組(NA)之間存在顯著差異基因256個，其中上調基因34個，下調基因222個。對差異表達基因功能注釋分析表明，在體外干預培養小鼠卵巢的過程中，FSH主要對小鼠卵巢生殖相關的細胞元件生成、生殖結構發育、核糖體生成、性腺發育、雌性性腺發育等GO功能類基因有一定影響，并通過趨化因子、ErbB、促性腺激素釋放素、粘著斑、血管內皮生長因子、神經營養蛋白因子等信號通路干預小鼠卵巢體外培養。

小鼠；卵巢；FSH；數字基因表達譜

卵巢深低溫凍存再移植技術將有可能幫助女性恢復或延長生育能力，特別是對于女性癌癥患者，在治療腫瘤前可利用該技術體外保存其生殖細胞。但是體外凍存和移植過程中會對卵巢造成一定的損傷。Aubard和張皓云等人在移植卵巢組織時發現，移植造成了一半以上的原始卵泡的損失[1-2]。對于雌性哺乳動物，母體卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone，FSH)是一類重要的性激素，其與生殖系統密切相關。有研究表明，若在卵巢組織移植過程輔以FSH，可最大限度地提高卵泡和卵母細胞的直徑，提高次級卵泡的百分比，說明FSH對卵泡的生長發育有重要作用[3-4]。本課題組前期研究發現，將體外培養的小鼠卵巢組織移植回體內時，經體外FSH短暫干預培養的小鼠卵巢組織在血流重建時間和卵泡閉鎖抑制等方面，均要優于未經FSH干預組[5]，但尚不清楚其作用機理。

作為新一代高通量測序技術，數字基因表達譜(Digital Gene Expression Tag Profiling，DGE)可針對某一物種特定組織的特定狀態下mRNA的表達情況，進行全面、精準、快速的檢測，獲得物種特定組織、特定狀態的基因表達圖譜，從而在基因表達水平進行數字化分析。本研究利用DGE技術，對體外FSH干預的小鼠卵巢組織構建其數字基因表達譜，初步分析其作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物為SPF級的ICR品系雌性小白鼠，購自寧夏醫科大學實驗動物中心，雌性小白鼠體重(20±2)g。主要試劑為卵泡刺激素(FSH)：注射用重組人卵泡刺激素(果納芬)。

1.2 實驗方法

1.2.1 試劑的配制

基礎培養液：DMEM/F12(5 g)、鏈霉素(0.1 g)、Hepes(2.38 g)、NaHCO3(2.388 g)、二甲基亞砜(10 mL)、青霉素(10萬IU)。用NaHCO3將基礎培養液pH值調至7.2～7.4，將調制好的基礎培養液經0.22 μm的微孔濾器過濾除菌備用。在卵巢體外培養過程中，FSH干預組為在基礎培養液內添加FSH至終濃度達到0.3 IU·mL-1。基礎培養液在使用前加入10 % 小牛血清。

1.2.2 卵巢的獲取

通過觀察小鼠動情周期陰道涂片，取其雙側卵巢，將每只小鼠的兩個卵巢隨機分成FA和NA組。

1.2.3 實驗分組

根據研究目的，將100只雌性小鼠的200枚卵巢分為FA和NA 兩組(FA組為0.3 IU·mL-1FSH 體外干預培養12 h，NA組為無FSH體外干預培養12 h)。

1.2.4 總RNA提取與純化

利用TRizol提取法提取卵巢組織總RNA，并進行純化。使用生物分析儀檢測總RNA的濃度和純度，檢測前RNA均經過DNaseI處理。

1.2.5 RNA測序樣品處理

利用Oligo(dT)磁珠取6 μg待測樣本總RNA，對其mRNA進行吸附和純化。純化后的mRNA反轉錄合成雙鏈cDNA。用內切酶NlaIII(識別位點為CATG)處理雙鏈cDNA，再利用磁珠對其純化，并在其5’末端連上測序所需的接頭1。用MmeI內切酶(識別位點為CATG，切割位點為識別位點下游17 bp處)處理測序樣品，產生大量帶有接頭1的標簽序列和帶有磁珠的序列。再利用磁珠吸附沉淀去除3’片段后，剩余即為帶有接頭1的測序樣品，在其3’末端連上接頭2，獲得5’和3’端連有不同接頭的21 bp標簽序列庫，純化后上機測序(圖1)。

圖1 測序標簽制備的原理和步驟

1.2.6 測序數據的獲取

因測序所得到的原始數據含有3’端接頭序列和部分低質量數據，需對其行處理。去除3’端接頭、空片段、低拷貝片段和長度過大或過小的序列，最終得到干凈的測序數據。

1.3 測序數據生物信息學分析

對全部干凈的測序數據與GenBank小鼠基因組數據庫進行比對，并進行基因注釋。此外，為了獲得測序樣本中基因表達量，以保證基因表達水平更加準確，需對測序數據進行標準化，標準化方法為：每個基因包含的原始干凈的標簽數/該樣本中總干凈的標簽數×1 000 000。

通過對差異基因進行P-value多重假設檢驗校正，篩選FSH干預培養的小鼠卵巢差異基因(FDR≤0.001，差異倍數為2倍以上)。利用Cluster軟件，對FA和NA樣本中差異基因表達模式進行聚類分析。

對FA和NA樣本中差異表達基因分別進行GO(Gene Ontology)功能顯著性富集分析和Pathway顯著性富集分析，以明確差異表達基因在分子生物學功能(molecular function)、所在細胞中的位置(cellular component)、參與行使的生物進程(biological process)和參與主要的生化代謝途徑和信號傳導途徑中的作用。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取與純化

對FA和NA樣本卵巢組織總RNA的濃度和純度進行檢測，RNA完整指數RIN>=7.0，28S/18S>0.7，即本實驗樣品可用，見圖2。

圖2 總RNA產物檢測圖譜注：F為FSH干預培養小鼠卵巢；N為無FSH干預培養小鼠卵巢

2.2 質量分析

2.2.1 測序質量評估

測序質量評估表明，在NA和FA樣本中，干凈的數據總量占比分別達到93.59%和91.74%，干凈的數據種類數占比分別達到39.29%和33.99%，說明測序標簽測序總量達標，測序質量很高，有效標簽覆蓋率足夠后續實驗需要，測序信息可用于后續數據分析，具體結果見圖3。

圖3 測序質量分析圖

2.2.2 測序飽和度分析

隨著測序進程的推進，測序量也隨之增加。從圖4可以看出，無論是NA組還是FA組，基因數在測序數據量達到2 M時均趨于飽和。

圖4 樣本飽和度分析圖

2.2.3 干凈標簽拷貝數分布統計

通過對干凈標簽數據進行統計分析，可以判斷其相應基因的表達量，且可以從整體上評估數據的可靠性。本研究結果表明，在兩組樣本中，拷貝數大于100的高表達標簽種類數雖然很少(占比分別為3.02%和2.79%)，但表達量都超過了62%；而拷貝數小于5的標簽雖然表達量小(占比分別為7.86%和8.46%)，但種類數上非常豐富，分別占mRNA總數的63.61%和67.05%，說明不同基因的mRNA在細胞中的表達是不一致的，除少量基因高表達外，大多數基因在mRNA的表達水平都很低(圖5)。

圖5 Clean Tags拷貝數分布統計圖

2.3 差異基因的表達分析

以FDR≤0.01且差異基因表達量倍數在2倍及以上為篩選標準，發現FA組與NA組的小鼠卵巢存在顯著的基因差異，共有差異基因256個，其中高表達差異基因34個，低表達差異基因222個。

2.4 差異表達基因GO功能顯著性富集分析

對FSH體外干預和無FSH干預的小鼠卵巢培養12 h表達差異基因進行GO功能分類。結果顯示FSH干預后，在細胞組分Ontology中有196個基因差異表達，顯著富集在細胞內(intracellular part)、膜結合細胞器(membrane-bounded organelle)等6個GO-term中。在分子功能Ontology中有193個基因差異表達，雖然沒有顯著富集，但大部分基因主要集中于結合功能的基因上。在生物學過程Ontology中，有188個差異基因表達，雖然也沒有顯著富集，差異基因主要集中在核糖核蛋白復合(ribonucleoprotein complex biogenesis)、細胞元件的生成(cellular component biogenesis at cellular level)、生殖結構發育(reproductive structure development)、核糖體生成(ribosome biogenesis)、性腺發育(gonad development)、雌性性腺發育(female gonad development)等過程中。圖6僅以P-value<0.05為閾值定義差異表達基因中顯著富集的GO-term。

圖6 FSH干預差異表達基因GO功能分類

2.5 差異表達基因信號通路(Pathway)顯著性富集分析

對FA組和NA組小鼠卵巢201個差異基因進行Pathway分析，將P-value<0.05的信號通路定義為在差異表達基因中顯著富集的通路。以此為標準，FSH體外干預小鼠卵巢差異基因主要集中在10個信號通路中，分別為：趨化因子信號通路(Chemokine signaling pathway)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、促性腺激素釋放素信號通路(GnRH signaling pathway)、粘著斑信號通路(Focal adhesion signaling pathway)、Fc epsilon RI signaling pathway、血管內皮生長因子信號通路(VEGF signaling pathway)、神經營養蛋白因子信號通路(Neurotrophin signaling pathway)、半乳糖代謝信號通路(Galactose melabolism signaling pathway)、神經膠質瘤信號通路(Glioma signaling pathway)和間隙連接信號通路(Gap junction signaling pathway)(表1)。

表1 NA vs FA的Pathway顯著富集列表(Top 10)

3 討論

目前，可通過DNA-RNA雜交、差異顯示、表達序列標簽等技術對生物在不同生長發育階段和處理條件下的差異基因進行比較，并獲得基因表達圖譜，但由于此類技術存在一定的缺陷，以至于獲得的基因表達模式信息有限，不能對差異基因進行定量研究。近年來，研究人員多采用基因芯片技術研究高通量基因差異表達，但該技術需事先制備大量已知cDNA或寡核苷酸序列分子探針，再采用特殊方法固定或原位合成在支持物上，對選定的基因進行表達模式分析[6]。本實驗采用DGE技術具有高通量和高靈敏性的優勢，不需要獲得目標基因序列，可更準確、全面、高效地從全轉錄組水平反映生物體在生長發育過程中基因表達變化情況[7-8]。在本研究中，對照組和實驗組測序樣本量均達2 M飽和狀態，通過樣本質量分析和拷貝數分布統計，均表明測序樣本信息充足、精確；但是，因基因組序列信息不足，對基因注釋及差異表達基因的功能注釋有一定影響，限制了表達譜數據的深入發掘和全面分析。

作為天然卵泡存活因子，FSH可影響女性卵巢的生殖和內分泌功能[9]。在卵巢體外玻璃化凍存過程中，因低溫凍存會對卵巢造成一定損傷，已有研究員人員通過加入FSH以降低卵巢凍存損傷。陳杰等[10]研究發現，給不同時段的玻璃化凍存卵巢添加FSH，添加FSH的卵巢中含有的正常卵泡要顯著高于不添加FSH的卵巢。除此之外，Magalhes等[3]研究發現，培養卵巢組織時，在FSH添加組中，卵泡和卵母細胞的直徑以及次級卵泡的百分比都比不添加FSH組的卵巢要高，說明FSH對卵泡的生長發育有極其重要的作用，但尚不清楚FSH作用卵巢的機理。

在本研究中值得注意的是，差異基因在趨化因子信號通路和粘著斑信號通路相對更為顯著富集。趨化因子在機體的免疫過程中發揮著重要作用，其趨使白細胞等免疫細胞在各循環系統和組織間游走并活化，清除感染源，促進創傷愈合。除此之外，趨化因子還對腫瘤生長的調節、移植免疫排斥、神經系統發育等方面起著重要作用。同時，相當一部分的趨化因子還是細胞生長因子，促使血管生成或參與胚胎期免疫系統的形成[11-13]。本研究中，趨化因子信號通路富集了12個差異基因，我們推測體外培養小鼠卵巢是一種缺血缺氧的過程，FSH通過該信號通路參與了卵巢的血管生成與血管內皮細胞的抗凋亡。

4 結論

本研究對體外FSH干預培養12 h的小鼠卵巢差異表達基因進行分析，發現差異基因在Gene Ontology和Pathway上顯著富集，說明FSH參與卵巢生殖結構發育、性腺發育、雌性性腺發育和細胞內核糖體生成等生物學發育過程，并通過趨化因子信號通路、ErbB信號通路、促性腺激素釋放素信號通路、粘著斑通路、血管內皮生長因子信號通路和神經營養蛋白因子信號通路等體外干預小鼠卵巢，為FSH應用于抗卵巢玻璃化凍存損傷提拱了一定的理論支持。

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The Construction and Basic Analysis of DGE About Mouse Ovarian Intervened by FSH in Vitro

MA Chun-ji1,2,ZHANG Xiao-guang3,PEI Xiu-ying2,4,WANG Yan-rong4

(1. Department of Biology and Pharmaceutical Technology, Ningxia Polytechnic College, Yinchuan Ningxia 750021,China; 2.Ningxia Institute of Med. Sciences, Yinchuan Ningxia 750004, China; 3.The Second Affiliated Hospital of Henan Luohe Medical College,Luohe Henan 462300,China; 4. Key Laboratory of Fertility Preservation and Maintenance of Ministry of Education, Ningxia Medical University,Yinchuan Ningxia 750004,China)

Using technology of digital gene expression tag profiling to construct the gene expression profile of mouse ovarian intervened in vitro by FSH, and analyze the expression of differential genes. The estrum mouse ovarian were divided into 2 groups, one cultured with FSH 12 hours(FA), the other cultured without FSH 12 hours(NA).Then analyze the Gene Oncology and Pathway. There are 256 differential genes between FA and NA，including 34 up-regulated genes and 222 down-regulated genes. The Gene ontology analysis of differential genes demonstrate that FSH has effect on GO functional genes about cellular component biogenesis at cellular level, reproductive structure development, ribosome biogenesis, gonad development, female gonad development and these genes have taken part in signaling pathways including Chemokine,ErbB, GnRH, Focal adhesion,Fc epsilon RI, VEGF, Neurotrophin when mouse ovarian intervened by FSH in vitro.

mouse;ovary;FSH;DGE

2016-09-01

寧夏回族自治區自然科學基金項目“小鼠卵巢組織特異性啟動子OSP1和DHEA基因真核表達載體的建立及活性研究”(NZ12285)；寧夏科技支撐計劃項目“促性腺激素干預移值卵巢基因表達的蛋白質組學研究”(寧科計字 [2012]17)。

馬春驥(1983- )，男，講師，碩士，從事生物化學與分子生物學研究。

王燕蓉(1957- )，女，教授，博士生導師，從事生殖醫學研究。

Q954.3

A

2095-7602(2017)02-0059-07