蛋白質含量測定方法概述

趙燕萍

摘要：食品中蛋白質含量是衡量其營養價值高低的一項重要指標，因此有關蛋白質的分析檢測對于人和動物健康來說尤為重要。目前所采用的蛋白質含量檢測方法主要有凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲法、考馬斯亮藍法等，本文就實驗室常用的幾種蛋白質檢測方法及其特點分別作簡單介紹。

關鍵詞：蛋白質含量測定；方法；特點

蛋白質含量的測定是目前生物化學中常用的一項指標測定。目前國內外所采用的檢測方法主要有凱氏定氮法、紫外吸收法、雙縮脲分光光度法、考馬斯亮藍法（Bradford法）、Lowry法、二辛可酸比色法（BCA法）、熒光光度法、電流法、毛細管電泳分析法、羅丹明生物探針法以及高效光譜遙感技術分析法等。

每種測定法都有其優勢，但也不可避免存在一定缺點。實驗中，應綜合考慮各方面因素再選擇最佳使方法。實驗對測定所要求的靈敏度和精確度、蛋白質的性質、溶液中存在的干擾物質、測定所要花費的時間等因素都會影響最終實驗方法的選擇。

本文主要就幾種常見的蛋白質測定方法的原理及特點作一簡單概述、比較。

1 凱氏定氮法

1.1基本原理

凱氏定氮法包括微量定氮法和全量定氮法兩種方法，其測定蛋白質含量的過程主要包括消化、蒸餾、吸收、滴定等步驟。

含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉變成氨，并進一步與硫酸作用生成硫酸銨，此過程稱為“消化”。濃堿可使消化液中的硫酸銨分解，游離出氨，借水蒸汽將產生的氨蒸餾到硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，溶液中氫離子濃度降低。用標準無機酸滴定，直至恢復溶液中原來氫離子濃度為止，即可根據所用標準酸的當量數計算出待測物中的總氮量。蛋白質中的氮含量一般為16%，據此推斷蛋白質含量。

1.2 方法特點

該方法儀器裝置簡單，試劑用量少且廉價易得。精密度、準確度高，最低可檢出0.05mg氮，且樣品用量少。但操作較繁瑣費時，不利于大批樣品的測定，且測定的結果只能是粗蛋白質的含量，處理未知樣品時，其誤差還有變大的危險。

1.3適用場合

適用于一切形態的食品與生物樣品。對于不溶和渾濁的樣品，其他許多方法不能進行測定，凱氏定氮法是唯一可行的分析方法。

2雙縮脲法

2.1基本原理

雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出1個分子氨后得到的產物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能夠以一個中間碳原子相連的肽鍵，都有雙縮脲反應。蛋白質發生雙縮脲反應時，紫色絡合物顏色的深淺與其濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用以測定蛋白質含量。

2.2方法特點

該方法操作簡便，試劑單一，可快速測定蛋白質含量，測定受蛋白質種類和環境溫度的影響小。但靈敏度差，測定范圍僅為1～20mg蛋白質。

2.3適用場合

適用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定，常用于谷物蛋白質含量測定。

3紫外吸收法

3.1基本原理

蛋白質分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的能力。在280nm具有吸光度是蛋白質的一種普遍性質。一定范圍內，蛋白質溶液在280nm的吸光度與其濃度成正比。

3.2方法特點

該方法不消耗樣品，測定后樣品仍能回收，低濃度鹽類不干擾測定，且簡便、靈敏、快速。但也存在缺點：①在測定與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差。②若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質，會對結果產生較大干擾。③蛋白質吸收高峰常因pH的改變而有變化，因此樣品與標準蛋白溶液的pH值若不同，會影響樣品中蛋白含量的測定。

3.3 適用場合

適于用測定與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。在蛋白質和酶的生化制備中（特別是在柱層析分離中）廣泛應用。

4 考馬斯亮藍法

4.1 基本原理

考馬斯亮藍法是根據蛋白質與染料相結合的原理設計的。考馬斯亮藍是一種有機染料，在游離狀態下呈紅色，在稀酸溶液中與蛋白質的堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基結合后變為藍色，在蛋白質含量為1～1000μg范圍內，蛋白質-色素結合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質含量成正比。

4.2方法特點

該法易于操作，干擾物質少，所用試劑較少，顯色劑易于配制。同時考馬斯亮藍與蛋白質結合反應十分迅速而穩定，2min左右即達到平衡，其結合物室溫下1h內保持穩定，且在5～20min之間，顏色的穩定性最好。

但由于各種蛋白質中的堿性氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，考馬斯亮藍法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用γ-球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。

4.3適用場合

該方法適用于要求靈敏度高、快速定量測定微量蛋白質的測定。

5總結

蛋白質測定方法有十幾種，在常用測定方法中，考馬斯亮藍法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏10～20倍。凱氏定氮法測定結果較為準確，靈敏度高，故往往以該法測定的蛋白質作為其他方法的標準蛋白質。但凱氏定氮法操作過程比較復雜繁瑣，測定也較費時，且會產生大量有毒有害氣體，危害操作者的身體健康，污染環境。紫外吸收法和考馬斯亮藍法都是較為快速的測定方法。另外，不同方法下不同物質對蛋白測定的干擾也不同。故對于不同樣品，應選擇合適方法測定，如對測定結果要求較高，則往往需要結合多種方法測定，并分析測定結果，最終得出最準確蛋白含量值。

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