葉酸代謝關(guān)鍵酶MTHFR和COMT血漿蛋白表達(dá)與不孕癥的相關(guān)性

劉菊芬 李悅姍 任愛國

不孕癥已成為影響人類發(fā)展與健康的一個全球性醫(yī)學(xué)和社會學(xué)問題。不孕癥患者不僅承受著身體痛苦，且多數(shù)伴有明顯的抑郁焦慮等心理壓力[1]，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。Meta分析發(fā)現(xiàn)我國總合并不孕率為5.7%，新婚人群1年和2年合并不孕率分別為12.5%和6.6%[2]。不孕癥病因復(fù)雜，盆腔感染[3]、精神壓力大[4]、多次人工流產(chǎn)術(shù)[5]、粉塵接觸等不良環(huán)境因素[6-7]均是不孕癥的危險因素。

葉酸缺乏和葉酸利用不足被認(rèn)為與不孕的發(fā)生有關(guān)。作為葉酸代謝的關(guān)鍵酶，5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydro folate reductase,MTHFR)基因多態(tài)性與男性不育、復(fù)發(fā)性(習(xí)慣性)自然流產(chǎn)的發(fā)生有關(guān)[8-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，編碼兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-O- methyltr1ansferase,COMT)的COMT基因可能單獨或與MTHFR基因聯(lián)合作用參與葉酸代謝過程[11]。此外，COMT由于參與雌激素的合成和代謝過程，在多囊卵巢綜合征、卵巢早衰、子宮內(nèi)膜異位癥等導(dǎo)致不孕癥的常見疾病中被廣泛關(guān)注。COMT基因突變可引起酶的活性改變，引起DNA氧化損傷，引起卵泡發(fā)育遲緩導(dǎo)致不排卵或者卵巢早衰[12]。關(guān)于MTHFR和COMT血漿蛋白表達(dá)產(chǎn)物是否與不孕有關(guān)，目前尚未見報道。本研究將對以上關(guān)系進(jìn)行探索，對進(jìn)一步闡明我國不孕癥的發(fā)病機制和確定篩選高危人群或易感個體的分子標(biāo)志物具有理論意義，從而為實施目標(biāo)明確的個體預(yù)防、制定基于人群的預(yù)防干預(yù)措施提供理論依據(jù)。

對象與方法

1.對象：課題組于2009年11月—2012年7月在山西省兩縣(壽陽縣和昔陽縣)利用婚前保健項目募集研究對象，建立婚檢婦女隊列。新婚夫婦在領(lǐng)取結(jié)婚證前均先進(jìn)行免費的婚前醫(yī)學(xué)檢查。項目縣同時建立了孕產(chǎn)期保健系統(tǒng)，新婚婦女懷孕后，均需要到其所在地的縣婦幼保健院建冊登記，該系統(tǒng)可隨時記錄新婚婦女的懷孕結(jié)局。隨訪追蹤婦女新婚1年后的懷孕結(jié)局，確診不孕婦女后，采用1:1匹配病例-對照研究。病例為婚檢時未懷孕、1年內(nèi)有懷孕計劃，婚后未避孕、有正常性生活、同居1年內(nèi)未懷孕者，排除男性不育因素且未接受過治療；經(jīng)腹腔鏡手術(shù)檢查排除輸卵管、子宮等內(nèi)生殖器官的先天性病變、阻塞和生殖器結(jié)核等，排除經(jīng)二級以上醫(yī)院診斷的多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位癥等臨床疾病患者。對照組為同期募集的年齡和居住地相近、婚后未避孕、有正常性生活、同居1年內(nèi)懷孕的婦女。本研究獲北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，研究對象進(jìn)行問卷調(diào)查和采集血標(biāo)本前，征得本人同意并在知情同意書上簽字。

2.調(diào)查內(nèi)容：設(shè)計調(diào)查表，收集研究對象人口學(xué)特征(如年齡、受教育程度、職業(yè)等)、既往生育史和患病史、葉酸增補情況、生活環(huán)境暴露(如農(nóng)藥、有機溶劑、重金屬等)、生活方式(如吸煙、飲酒、飲茶)和營養(yǎng)狀況等信息。調(diào)查由經(jīng)過培訓(xùn)的調(diào)查員完成。對調(diào)查表的流行病學(xué)資料采用雙重錄入和邏輯核查對數(shù)據(jù)錄入進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.不孕夫婦的臨床檢查：不孕夫婦的臨床檢查由當(dāng)?shù)貗D幼保健院婦科和男科醫(yī)生負(fù)責(zé)。女性檢查包括問診、體檢、血生化檢查、陰道B超、輸卵管通液等。男性檢查包括問診、體檢、血生化檢查、精液常規(guī)檢查等。精液分析用于排除男性不育原因。

4.生物樣本的采集和檢測：符合條件的婚檢婦女募集時采集外周肘靜脈血6 ml。采用微生物法檢測血液葉酸濃度，酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immune sorbent assay,ELISA)檢測COMT和MTHFR血漿蛋白表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司)，實驗步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行，加入終止液后在450 nm處測吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測算標(biāo)本內(nèi)目標(biāo)蛋白含量。

結(jié)果

1.研究對象的一般特征：隊列共募集了2 035名參加婚檢并計劃在未來12個月內(nèi)生育的婦女，并隨訪了妊娠結(jié)局信息。隨機抽取20例不孕婦女為不孕組，20例懷孕婦女為對照組。

40例研究對象平均年齡(25.9±3.0)歲，平均體重指數(shù)(24.9±4.7)kg/m2。受教育程度以初中為主，從事職業(yè)以農(nóng)業(yè)為主；兩組年齡、居住地、受教育程度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；體重指數(shù)、職業(yè)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。兩組均未患乙型肝炎、甲亢、貧血、糖尿病、高血壓、癲癇等慢性病。不孕組服用葉酸比例為5.3%，日常接觸汽油等有機溶劑的比例、居住地2公里內(nèi)有其他礦的比例、家里養(yǎng)貓/狗的比例、做飯使用煙煤的比例均高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.兩組血液葉酸水平比較：不孕組葉酸水平略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

3.兩組MTHFR、COMT血漿表達(dá)蛋白水平比較：不孕組MTHFR、COMT血漿蛋白表達(dá)水平均略高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表1 兩組一般特征比較

注：兩組比較，*P<0.05

表2 兩組葉酸、COMT、MTFHR血漿蛋白水平比較

討論

不孕癥病因復(fù)雜，葉酸缺乏或利用不足均增加不孕發(fā)生風(fēng)險，且逐漸受到重視。葉酸參與體內(nèi)一碳單位轉(zhuǎn)運，為合成DNA、RNA所必需，是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的微量營養(yǎng)素。葉酸是人體自身無法合成，需要通過外源性食物攝取的B族水溶性維生素。

葉酸進(jìn)入體內(nèi)的代謝和利用受到葉酸代謝相關(guān)基因調(diào)控的影響。備受關(guān)注的是MTHFR，其677CT和1793GA基因型在女性對照組遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原因不明性不孕組[10]，MTHFR與其他基因交互作用增加子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的不孕發(fā)生風(fēng)險[11]；也有研究指出，MTHFR677C>T變異引起的酶的活性改變并不影響IVF的種植率[12]。也有研究并未發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性(677C>T和1298A>C)與不孕發(fā)生風(fēng)險有關(guān)[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，COMT基因可能單獨或與MTHFR基因聯(lián)合作用參與葉酸代謝過程，導(dǎo)致體內(nèi)同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平升高，產(chǎn)生神經(jīng)管缺陷等不良結(jié)局[11]。COMT基因突變導(dǎo)致酶的活性降低，通過增加組織中雌激素和兒茶酚含量，引起DNA氧化損傷，從而增加激素依賴性的疾病發(fā)生風(fēng)險[13]。研究者發(fā)現(xiàn)，多囊卵巢綜合癥中，由于COMT過表達(dá)，卵巢顆粒細(xì)胞中由羥雌二醇(2-hydroxyestradiol,2-HE)甲基化生成的甲氧雌二醇(2-Methoxyestradiol,2-ME)增加，類固醇生成障礙，卵泡發(fā)育遲緩，導(dǎo)致不排卵[14]。巴西研究者最近研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢早衰細(xì)胞中，則表現(xiàn)出相反的趨勢，COMTrs4680等位基因A的頻率基因突變可增加與卵巢早衰的發(fā)生，卵巢早衰患者等位基因A的頻率高于對照組；卵巢早衰患者COMT活性降低，2-ME生成減少，促進(jìn)卵泡衰竭，最終導(dǎo)致卵泡發(fā)育遲緩[15]。最近的一項Meta分析發(fā)現(xiàn)，COMT158G/A多態(tài)性位點顯著增加子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌癥的發(fā)生風(fēng)險，特別是在亞裔人群中[16]。但是也有研究得出不一致的結(jié)論，例如美國研究者發(fā)現(xiàn)COMT基因多態(tài)性不是多囊卵巢綜合癥的危險因素[17]，巴西研究者并未發(fā)現(xiàn)COMTrs4680(val/met)突變與子宮內(nèi)膜異位癥合并不孕有關(guān)[18]。

關(guān)于COMT的蛋白表達(dá)，研究不多。例如研究者通過Western-blot方法檢測重度子癇前期產(chǎn)婦胎盤組織COMT蛋白表達(dá)量明顯低于正常產(chǎn)婦，推測胎盤組織中的COMT參與重度子癇前期的發(fā)病[19]；也有研究通過采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測妊娠婦女胎盤組織COMT mRNA的水平，發(fā)現(xiàn)子癇前期組胎盤組織COMT mRNA水平明顯低于對照組[20]，但是具體機制有待進(jìn)一步研究。對結(jié)直腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組可溶性COMT(S-COMT)蛋白的表達(dá)水平顯著高于正常結(jié)直腸黏膜，可能與COMT高表達(dá)導(dǎo)致癌組織中雌激素分解代謝增加有關(guān)[21]。COMT和MTHFR在不孕癥中的表達(dá)尚無報道。本研究發(fā)現(xiàn)，COMT和MTHFR在不孕組略高于對照組，可能與激素水平改變有關(guān)。由于樣本量所限，本研究未進(jìn)一步對不孕類型區(qū)分。

不孕癥的發(fā)生是基因、環(huán)境及基因—環(huán)境共同作用的結(jié)果。本研究通過小樣本量的研究初步探究了葉酸代謝通路上關(guān)鍵酶的表達(dá)水平與不孕癥的關(guān)系，血液中與葉酸代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)水平是否有所改變是本研究的重要關(guān)注點。本研究初步揭示了不孕組COMT、MTHFR血漿蛋白均略高于對照組，血液中與葉酸代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)水平與不孕癥的關(guān)系，有待今后大樣本量的研究去驗證。

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