陜西西安地區漢族孕齡女性MTHFR基因多態性的分布研究

楊文方 王加麗 張彤 金曦 李文靜 李丹陽 王翔 黨曦虹 張昌寧

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是葉酸和同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)代謝的關鍵酶，主要功能是將5，10-亞甲基四氫葉酸不可逆還原為5-甲基四氫葉酸。5-甲基四氫葉酸作為體內甲基的主要供體，參與體內嘌呤、嘧啶、DNA、RNA和蛋白質的甲基化修飾。MTHFR cDNA上677位堿基C->T變異可促進該酶分解為單體及輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的解離，進而導致MTHFR催化活性下降，致使體內葉酸的活性形式即5-甲基四氫葉酸生成減少，從而影響DNA、RNA和蛋白質等各種重要大分子的甲基化修飾，導致甲基化程度異常，最終影響胚胎發育[1]；另一方面，由于5-甲基四氫葉酸生成減少，導致Hcy轉變成甲硫氨酸過程出現障礙，使血漿Hcy水平異常升高，因而是神經管畸形、復發性流產、妊娠期高血壓等疾病的重要危險遺傳因素[2]。目前MTHFR多態性和葉酸關系是近些年研究熱點。國內多個地區已有人群中MTHFR多態性的報道[3]。本研究旨在采用穩定性和準確性均較高的PCR-芯片法分析西安地區MTHFRC677T位點基因多態性的分布情況，同時和中國其他地區進行比較，進而為出生缺陷一級預防策略的制定提供科學依據。

對象與方法

1.對象：依據知情同意原則，隨機抽取2013年6月—2016年2月在西安交通大學第一附屬醫院進行孕前或早孕檢查的漢族孕齡健康女性，排除DNA提取不合格者，有效入組對象共1 966例，年齡18～43歲，平均(28.6±3.9)歲。

2.基因測定：DNA的提取抽取患者外周靜脈血2 ml于EDTA抗凝管中，即時提取DNA。用人全血DNA提取試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)提取DNA后，存放于-20 ℃冰箱用作下一步實驗。MTHFR基因型測定采用PCR-芯片雜交顯色試劑盒(上海百傲科技股份有限公司)檢測MTHFR基因型。

PCR擴增引物序列如下：上游5′-CAAAGGCCACCCCGAAGC-3′和下游5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′，反應體系25 μl:1 mmol/L MgCl2、dNTP 200 μmol/L、正反引物各0.5 μmol/L、TaqDNA聚合酶2 U、模板DNA 5 μg。PCR擴增條件如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環，末次延伸5 min。取10 μl PCR反應產物進行雜交顯色，然后用芯片識讀儀讀取患者基因型。

3.統計學處理：采用SPSS 13.0軟件。考慮到多重檢驗可能增加犯一類錯誤的概率，本研究利用R語言通過FDR法(false discovery rate)校正P值。采用Pearson相關性檢驗分析不同地域省份經度、緯度和突變等位基因頻率的相關性。利用非參數檢驗Kruskal-Wallis法分析南北方地區的突變型等位基因頻率的差異。采用χ2檢驗比較本研究和北方總體和南方總體等位基因頻率的差異。不同區域的聚類分析采用系統聚類法和K-means聚類法進行。P<0.05為有差異有統計學意義。

結果

1.采用PCR-芯片法對MTHFRC677T分型結果及Hardy-Weinberg平衡檢驗：采用芯片法可清晰地檢測出樣本MTHFRC677T位點3種基因型。為了保證檢測結果的準確性，芯片上前三列是樣品DNA質量的質控點，且每種基因型都有平行重復(如第一行4、5和6點代表C基因型)和其交叉重復(如第二行7，8和9位置)，見圖1。Hardy-Weinberg平衡檢測顯示，三種基因型的P均>0.05，提示所選本遺傳平衡，具有一定的地區代表性。

圖1 MTHFR C677T基因分型結果 A、B、C依次表示基因型CC、CT和TT

2.西安漢族女性MTHFR基因多態性分布及南北方比較：西安地區漢族孕齡女性MTHFRC677T位點突變型T的頻率為53.3%。同時選取已經報道的北方6個地區(包括黑龍江、山東、河南、河北、天津、陜西)和已經報道的南方9個地區(包括江蘇、湖北、四川、云南、湖南、江西、廣西、廣東、海南)的MTHFRC677T基因型的分布，由于同一省份不同地域基因型分布很接近，將這些數據合并計算該地區的分布頻率，見表1。西安地區突變的T等位基因的頻率和之前報道結果類似(53.3%和54.3%)，說明該研究人群的選擇具有代表性。北方地區內部(χ2=81.570，P<0.001)和南方地區內部(χ2=363.214，P<0.001)突變型T等位基因頻率的分布各自存在明顯的異質性，因此，采用非參數檢驗Kruskal-Wallis法對我國北方和南方地區進行綜合分析，發現北方地區的突變型T等位基因頻率顯著高于南方地區，差異有統計學意義(P<0.001)。本研究中MTHFRC677T位點突變型T的頻率為53.3%，與北方6個地區平均突變頻率57.7%比較，差異無統計學意義(χ2=0.398，P=0.528)，但是卻明顯高于南方9個地區的平均突變頻率33.7%，差異有統計學意義(χ2=7.344，P=0.007)。

突變型T等位基因與緯度、經度的相關性研究發現，該突變型T等位基因的分布頻率與我國各地區的平均經度無相關性(r=0.471，P=0.065)；但是，該突變型T等位基因的分布頻率與我國各地區的平均緯度卻呈現正相關(r=0.868，P<0.001)。我國北方地區MTHFRC677T突變型T等位基因的頻率明顯高于南方，并隨著地域緯度的增加而顯著性升高,見表2。頻率最低出現在南方的海南，但最高地區卻出現在北方的山東，而不是緯度最高的黑龍江，提示除了緯度因素外，可能還有其他因素影響著該位點的突變頻率分布。西安地區與北方的黑龍江、天津的頻率分布均無差異，但低于北方的山東、河南、河北這些緯度較高地區，而又均顯著高于緯度較低地的南方9個地區。

3.不同區域MTHFRC677T聚類分析：采用系統聚類法分析不同區域MTHFRC677T基因型分布關系，表明本研究結果和天津、陜西、黑龍江關系最為接近。而北方地區可明顯聚成一類，南方地區聚為另一類，進一步說明MTHFRC677T基因型頻率的分布在我國存在南北區域差異，見圖2。

對各地域的基因型構成比數據，同時采用K-means聚類法進行分析。根據系統聚類法結果，將指定分類數目k設置為2，迭代次數設置為100。最終，K-means分析結果與系統聚類法結果一致，提示南方9個地區聚類為1組(T等位基因頻率聚類重心為0.337)，北方6個地區和本研究聚類為2組(T等位基因頻率聚類重心為0.571)，兩組差異有統計學意義(F=67.758，P<0.001)，見表3。

表1 不同地區漢族孕齡女性MTHFR C677T基因型和等位基因頻率比較

注：不同地區漢族孕齡女性MTHFRC677T基因型和等位基因頻率比較,*P<0.05

表2 突變型T等位基因與緯度、經度的相關性分析

注：突變型T等位基因頻率分布與緯度正相關，r=0.868，*P<0.001；與經度無相關性，P=0.065

圖2 MTHFR C677T基因型在我國15個地域的系統聚類分析

案例號區域聚類距離北方1本研究200382黑龍江200063山東200604河南200315河北200066天津200267陜西20028南方8江蘇100989湖北1006610四川1002311云南1002612湖南1001313江西1002014廣東1005215廣西1009516海南10097

注：F=67.758，P<0.001

討論

出生缺陷是我國嚴重的公共衛生問題和社會問題。西安地區的出生缺陷率在7.9‰～9.3%[12-13]，根據西安市統計學年鑒報道近些年新增新生兒在8.2萬左右，這意味著每年大概有648～760名先天性畸形兒出生，其中先天性心臟病、總唇裂和神經管缺陷是最主要的出生缺陷類型。目前遺傳因素是出生缺陷的重要影響因素，目前研究比較多的基因是MTHFR，尤其是其mRNA序列上C677T的突變可導致高度保守的丙氨酸變成纈氨酸。突變型的MTHFR酶活性降低，導致葉酸代謝紊亂，進而導致甲基化異常和血漿Hcy水平升高，進而導致出生缺陷如神經管缺陷[14]、先天性心臟病[15]的發病風險顯著升高。而且，MTHFRC677T的突變還會顯著增加早期妊娠丟失的風險[16]。

研究發現，MTHFR基因多態性分布存在地域特異性[17]。早在2003年就西安地區人群中MTHFR 677T多態性分布的報道[18]，但納入樣本僅有96名，難以反映MTHFR的基因型分布特征。本研究隨機抽樣并分析1 966名西安漢族健康孕齡女性MTHFRC677T基因多態性的分布特征，納入人群基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡，說明抽樣人群有很好的代表性。在和已報道省份數據比較發現MTHFRC677T的等位基因頻率分布和地理緯度有明顯的關系，突變基因型T的頻率從山東(63.1%)到最低的海南(24.0%)，和緯度呈明顯地正相關，這和我國神經管缺陷發病率北高南低的事實是相符的[19]。

由于不同地區人群的遺傳背景存在一定差異，因此出生缺陷一級預防策略的制定應該因地制宜、因人而異，改變和完善目前全國統一推行的一級預防干預模式。目前國家衛計委推薦預防出生缺陷的措施是在孕前3個月至孕早期3個月每日補充葉酸0.4 mg。但在補充相同劑量的葉酸2個月后，MTHFRC677T位點TT型孕婦血漿葉酸水平會顯著升高，而同型半胱氨酸明顯下降，但依然高于CC型孕婦[20]，提示著葉酸補充還應考慮遺傳多態性的影響。通過開展MTHFR的分子流行病學研究，了解不同地區人群的遺傳特征，進而為完善出生缺陷一級預防措施提供科學依據。

本研究發現，MTHFRC677T的等位基因頻率分布和地理緯度有明顯的關系，突變基因型T的頻率在我國從南向北逐漸增高。考慮到T突變基因型在我國北方人群中分布頻率比較密集，超過50%，且該基因型葉酸利用率較低，相同劑量的葉酸補充干預，該基因型需要更長的時間達到預防出生缺陷的體內微環境負荷量。因此，在出生缺陷的葉酸預防劑量上，在我國北方地區提高干預劑量，將有可能獲得更理想的一級預防效果。

1 Yamada K,Chen Z,Rozen R,et al.Effects of common polymorphisms on the properties of recombinant human methylenetetrahydrofolate reductase.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001,98:14853-14858.

2 Nazki FH,Sameer AS,Ganaie BA.Folate:metabolism,genes,polymorphisms and the associated diseases.Gene,2014,533:11-20.

3 Yang B,Liu Y,Li Y,et al.Geographical distribution of MTHFR C677T,A1298C and MTRR A66G gene polymorphisms in China:findings from 15357 adults of Han nationality.PloS one,2013,8:e57917.

4 馬路密,魯衍強,李瑛,等.尚志市漢族女性MTHFR與MTRR基因多態性調查.實用預防醫學,2015,22:289-291.

5 高峽,魯衍強,馬少杰,等.張家口地區漢族女性MTHFR和MTRR基因多態性分布.中國優生與遺傳雜志,2014:35-37.

6 李俊華,魯衍強,馬少杰,等.廊坊市漢族女性MTHFR與MTRR基因多態性分析.基礎醫學與臨床,2014,34:1564-1565.

7 羅秀莉,魯衍強,郭文竹,等.湖北松滋市漢族女性MTHFR與MTRR基因多態性分布.公共衛生與預防醫學,2014,25:29-32.

8 王維鵬,魯衍強,芮欣憶,等.湖北省漢族女性亞甲基四氫葉酸還原酶和甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態性分布研究.中國婦幼保健,2013,28:140-143.

9 王淑媛,魯衍強,馬少杰,等.湘潭市漢族女性MTHFR和MTRR基因多態性分布及其與血漿Hcy水平的關系.天津醫藥,2014,12:1205-1208,1209.

10 方園,魯衍強,薛琰,等.九江市漢族女性MTHFR、MTRR基因型和等位基因頻率分布與其他地區漢族女性的比較.中國婦幼保健,2015,30:1732-1735.

11 沈寅琛,魯衍強,李瑛,等.南寧地區漢族女性MTHFR與MTRR基因多態性研究.中國優生與遺傳雜志,2015,7:18-19,56.

12 張水平,宋曉彬,周引榮,等.西安市2003～2008年圍產兒出生缺陷調查研究.中國婦幼健康研究,2009,20:550-555.

13 張水平,梁艷,劉淑芳,等.圍產兒42 272名出生缺陷分析.中國兒童保健雜志,2004,12:259-261.

14 Yang Y,Chen J,Wang B,et al.Association between MTHFR C677T polymorphism and neural tube defect risks:A comprehensive evaluation in three groups of NTD patients,mothers,and fathers.Birth defects research Part A,Clinical and molecular teratology,2015,103:488-500.

15 Chen KH,Chen LL,Li WG,et al.Maternal MTHFR C677T polymorphism and congenital heart defect risk in the Chinese Han population:a meta-analysis.Genetics and molecular research :GMR,2013,12:6212-6219.

16 楊文方,樊靜,李丹陽,等.亞甲基四氫葉酸還原酶多態性與早期妊娠丟失風險的關系研究.中國婦幼健康研究,2015,26:1128-1130.

17 李進華,胡華梁,范松麗,等.河北省漢族女性亞甲基四氫葉酸還原酶與甲硫氨酸合成酶還原酶基因多態性.中國生育健康雜志,2015,26:219-222.

18 孫文萍,萬琪,蘇明權.西安地區漢族亞甲基四氫葉酸還原酶的兩種基因多態性.第四軍醫大學學報,2003,24:634-636.

19 代禮,朱軍,周光萱,等.1996～2000年全國神經管缺陷的動態監測.中華預防醫學雜志,2002,36:402-405.

20 張爽,魯衍強,芮欣憶,等.不同5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因型人群葉酸補服效果評價.天津醫藥,2013:628-631.