改良式羊水細胞培養及收獲在產前診斷染色體檢查中的應用

韋小妮 唐寧 王文丹

目前，經細胞培養行G顯帶染色體核型分析依舊是產前診斷染色體檢查的重要手段[1-2]。該技術由于培養條件、羊水質量、個體差異，操作者技術水平等諸多因素的影響，目前仍存在操作繁瑣耗時、易污染、分裂相少等問題[3-4]。此外，隨著染色體芯片技術在超聲異常但核型正常胎兒的檢測應用逐步顯現[5]，因此，對現有傳統細胞培養及核型分析技術進行改良優化，提高產前診斷效率，并為染色體芯片檢測提供優質實驗材料就顯得極為必要。為此，本研究在傳統的羊水細胞培養及收獲方法的基礎上進行不斷改良優化，取得了較為滿意的結果，現報告如下。

對象與方法

1.對象：收集2016年3—4月在本院接受產前診斷羊水穿刺、細胞培養及染色體核型分析的孕婦780例，孕周16～22+6周。產前診斷的指征包括產前篩查高風險、高齡孕婦、不良生育史、B超發現異?；蚍驄D之一為染色體平衡易位攜帶者等。

2.羊水標本的采集：根據知情同意的原則，孕婦排空膀胱，輕輕晃動腹部后，在B超介導下用一次性羊水穿刺針經腹穿刺抽取羊水16 ml，分裝于兩支14 ml無菌離心管(BD352001管)中，8 ml/支。

3.羊水細胞接種培養：將送檢的羊水細胞離心6 min(1800 rpm/min),棄去上清液，每管留1.5 ml羊水及其沉淀細胞，使用無菌吸管輕輕混勻，接種，傳統方法接種為將所有的懸液均接種于盛有3.5 ml羊水培養基(廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司)的培養瓶(BD公司的3531008培養瓶)中，丟棄羊水管，混勻，置37.0 ℃ 5.0% CO2培養箱中半開放式培養，而改良式方法較傳統方法不同之處在于僅取1 ml懸液進行接種，置37.0 ℃ 5.0% CO2培養箱中半開放式培養，盛有剩余的0.5 ml羊水沉淀細胞的無菌離心管留存于冷藏冰箱中待備用。

4.細胞培養、換液：培養至第6天時，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，有貼壁細胞生長時則進行換液，利用手腕力輕輕搖動培養瓶，棄去上清液，加入新鮮的羊水培養基3.5 ml，繼續培養，若未見貼壁細胞生長，尋找未生長的原因，若為污染所致則直接丟棄，并與臨床聯系，未發現具體原因的則繼續原瓶培養，培養至14天后仍未見細胞生長則及時與臨床聯系，視為培養失敗。

5.羊水細胞的收獲、制備

(1)傳統方法：于換液后的第2天取出，觀察細胞生長的情況，當細胞克隆≥3個大克隆(4倍鏡下>2/3視野)或不少于6個中克隆(4倍鏡下介于2/3視野和1/3視野)，且較多(總共≥30個)圓形透亮的有絲分裂細胞時，加入秋水仙堿(20 μg/ml，50 μl)繼續培養4 h后，即可收獲。在室溫條件下，將培養液轉移至離心管中，生理鹽水洗滌一次后，使用刮子輕輕刮取貼壁細胞使其脫落，轉移至離心管中離心6 min(1800 rpm/min),棄去上清液，加 4 ml 0.075M氯化鉀溶液，使用吸管吹打混勻，37 ℃水浴箱中低滲30 min,加入新鮮配制的固定液(甲醇：冰醋酸=3:1)0.5 ml，吸管吹打混勻，離心6 min(1800 rpm/min),棄去上清液，加入5 ml固定液固定，離心，重復一次，調制懸液，干片法制片，烤片，胰酶法G顯帶。按照人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN 1995)標準及行業標準進行核型分析。

(2)改良方法：區別于傳統方法，①倒棄上清液，無須留存上清液，無須生理鹽水洗滌，無需使用刮子進行刮取，直接加入0.25% EDTA-胰酶(上海源培)溶液進行細胞消化；②消化完成后直接轉移至離心管中，無須離心取沉淀，而是直接加入4 ml 0.075M氯化鉀溶液終止，輕輕水平混勻，37 ℃溫箱中進行低滲，低滲時間較傳統方法不同，為12 min；③使用漩渦混勻器震蕩混勻取代吸管吹打混勻。

6.觀察指標：隨機抽取留存在冷藏冰箱7～15 d后的羊水懸液110例(7天后的為15例，8天后的20例，9天后的為20例，13天后的為20例，14天后的為15例，15天后的為20例)，進行細胞培養，觀察其在培養后第6天的細胞克隆數。

結果

傳統及改良方法的細胞培養成率均達99.9%，兩種方法細胞培養失敗的標本為同一患者的標本，所得核型見圖1、圖2。在第7、8、9天，兩種方法可收獲數比較，差異無統計學意義；收獲到≥20個可供分析的分裂相數，兩種方法差異有統計學意義；在同批次收獲10個標本耗時中，改良法較傳統法平均省時30 min；見表1。

表1 兩種方法情況

注：兩種方法比較，*c2=90.52，P<0.05

圖1 改良式法所得核型

圖2 傳統法所得核型

第14天未能收獲的1例標本(在第18天才能收獲)，為同一患者的標本；采用留存的羊水懸液進行細胞培養，其在培養后第6天的細胞克隆數均不少于4個，多的甚至可達到12個。

討論

羊水細胞培養及核型分析是產前診斷的重要技術手段，是一項綜合性很強的技術。高質量的羊水細胞培養、收獲是進行羊水染色體核型分析診斷的關鍵。傳統的羊水細胞培養是將羊水離心后將所有的沉淀細胞均接種于培養瓶中，加秋水仙素培養后將貼壁細胞從培養瓶中用刮子將其慢慢刮落下來，然后用吸管轉移至離心管里進行離心、低滲、預固定和固定等，細胞培養周期長，容易發生污，一旦在生長過程中發生污染，則很難進行補救。此外，整個實驗過程極其繁瑣，每一個大環節中包括較多的小細節，例如收獲則包括加入秋水仙堿，脫落貼壁細胞，轉移脫落細胞至離心管中等，一旦在一個實驗環節中出現操作不佳或錯誤均可導致收獲不成功，或不準確，無法給患者提供一個可靠的結果。為此，國內有人提出倒出一半培養液，并加入新鮮培養液的等方法來提高成功率[6]，也有產前診斷實驗室提出利用舊培養基4 ℃冰箱保存2～12 d后分離其內細胞傳代培養等優化技術來提高細胞培養的成功率[7]，該法實施的前提是在培養的過程中有細胞克隆生長，但是該法中實驗室利用無菌耗材對舊培養基進行保存，增加了實驗室的支出，因方法的局限性，它無法為細胞在培養過程中受到污染導致培養失敗的標本提供補救措施，故一旦出現此情況只能重新取材進行實驗，但是產前診斷的標本來之不易，其取材需要耗費人力、物力，尤為重要的是還存在流產等風險[8-9]。因此，應該最大程度避免對孕婦進行再重新取材檢查，基于以上原因，本研究在傳統方法的基礎上，對接種和收獲過程進行改良。

改良法相對于傳統方法的優點如下。(1)留存有原始標本。改良式方法在保障細胞培養成功率(成功率為99.9%)、不延遲收獲周期和不額外浪費試劑、耗材、人力的前提下，保存了部分原始標本，這些標本可用于：重新進行細胞培養，本研究可得知羊水細胞置于冷藏冰箱中保存7～15 d，其細胞活性未見明顯降低，取出，復溫，也能成功培養出不少量的細胞；有利于真假嵌合體的分析，當兩線結果出現偏差時有利于溯源；當有需要進行染色體微陣列分析( chromosomal microarray analysis，CMA)等進一步檢查時提供原始材料，無需重新再取材，避免浪費，規避了風險。(2)優化了脫落貼壁細胞的過程。傳統方法中，人為使用刮子將貼壁的羊水細胞刮落，耗時長，且要求力度適中，慢慢地刮取，若力度不合適則不易將細胞脫落下來或脫落下來的細胞不易分散，最終導致收獲到的適用分裂相少，而改良法中，采用0.25% EDTA-胰酶溶液脫落細胞，無需人為用力，無需特定的技巧，只需在溫箱中溫育6 min，貼壁細胞即可完全自瓶中脫落下來。(3)收獲染色體的過程中，傳統方法使用吸管吹打，吸管錯位吹打，則易發生交叉污染，影響結果的準確性，而在改良法中采用漩渦混勻器進行混勻，無需使用吸管，其混勻所需時間較使用吸管時減少，節約了時間，過程中大大地減少了交叉污染的可能。(4)改良方法的操作步驟較傳統方法少，如脫落后的細胞可直接進行低滲，中途減少了一次離心的過程，又縮短了工作時間，故批次10個標本的實驗時間平均縮短了30 min，同時提高了收獲效率，如圖1和圖2所示，改良方法其所得到的核型較之傳統法的多、好，能夠用于發放報告的成功率達到100%。

此外，本研究對于培養失敗的標本和未能在14 d收獲的標本進行了原因分析及追蹤。(1)培養失敗的標本：該標本的羊水性狀未見明顯異常，羊水沉淀量不少，過程中培養基未見明顯渾濁跡象，培養至第14天，未見貼壁細胞生長，取1 ml培養瓶中的液體進行細菌、真菌培養，未見異常，懷疑可能為該孕婦本身的特異性引起的不明原因培養失敗，該孕婦重新取臍帶血進行培養行核型分析，核型未見明顯異常。(2)未能在14天收獲的標本：該羊水性狀異常，為褐色，離心后可見灰白色沉淀，故導致其羊水細胞生長緩慢，至第14天未能收獲，但是經過原瓶再分布及加液處理，在第18天可收獲，核型結果顯示未見明顯異常。由此得出，該標本是由于孕婦本身羊水異常導致其生長緩慢，收獲的時間拖后，但是只要實驗人員進行有目的的處理，其亦可得到足夠多的核型進行分析。

綜上所述，改良式羊水細胞培養及收獲的方法在產前診斷染色體檢查中的應用可在最大程度上避免孕婦再次羊膜腔穿刺及風險較高的臍帶血穿刺，進一步確保了一次性穿刺可達到產前診斷染色體檢查成功的效果，而且操作簡單，耗時少，具有廣泛的推廣應用前景。

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2 賴怡,劉之英,秦利.25510份孕中期羊水細胞的染色體分析.中華醫學遺傳學雜志,2015,32:117-119.

3 齊漫龍,趙彥艷,鄭高艷.羊水染色體制備技術的改進.中國醫科大學學報,2013,42:274-276.

4 韓美艷,俞冬熠,姜楠.影響羊水細胞培養成功率因素的分析.中國產前診斷雜志(電子版),2014,6:42-45.

5 染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用協作組.染色體微陣列分析技術在產前診斷中的應用專家共識.中華婦產科雜志，2014,8:570-572.

6 張志強,林少賓,謝英俊.改良孕中晚期羊水細胞培養方法的實驗研究.中華醫學遺傳學雜志,2014,31:109-110.

7 謝金芳,蔡富強,紀霞.同步化羊水細胞傳代培養在產前診斷中的應用.中華醫學遺傳學雜志,2014,10：666-668.

8 高勁松,劉俊濤.介入性產前診斷適應證和禁忌證及應用.中國實用婦科與產科雜志,2015,31:825-828.

9 呂時銘.高齡孕婦的產前診斷.中華檢驗醫學雜志,2016,39:401-403.