雙酚A亞慢性暴露對雌性小鼠卵巢儲備功能的影響

曹羽明 瞿鑫蘭 張銘 左馳 姚燕如 楊寒笑 張元珍

雙酚A(Bisphenol A,BPA)學名2,2-二(4-羥基苯基)丙烷，是近幾年廣受關注的一種環境內分泌干擾物，其具有弱雌激素活性，可以對人類健康產生復雜的影響，可涉及到全身多個器官，特別是生殖系統。以往對BPA生殖毒性的研究多著眼于其弱雌激素效應[1-3]，對卵泡發育及卵巢功能影響的報道偏少。近期研究表明，女性卵巢儲備功能下降與血尿BPA濃度相關，BPA可能影響卵泡發育進而降低卵巢儲備功能[4]。但安全劑量范圍內的BPA對剛進入性成熟期小鼠卵巢儲備功能的影響尚未見報道。本研究旨在探討低劑量BPA亞慢性暴露是否引起雌性小鼠卵巢儲備功能下降，為進一步解讀BPA的卵巢毒性提供理論依據。

對象與方法

一、對象

本課題已通過武漢大學中南醫院倫理委員會審批。動物實驗的實施及對實驗動物的應用操作已通過武漢大學A3實驗室批準。動物均麻醉后取血并處死，最大程度地減少對動物的傷害。

64只5周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠，體重15～17 g，購買于武漢大學A3實驗室并在此飼養應用。小鼠適應性飼養1周后，按體重隨機分為4組，每組16只。

二、方法

1.分組：BPA(分析純，純度≥97%)以玉米油為溶劑，配成5、50、500 μg/ml BPA溶液(BPA低、中、高劑量組)，僅玉米油處理作為溶劑對照組。每天上午8:00時開始小鼠稱重并按10 ml/kg溶液及組別灌胃，連續處理28 d。實驗動物飼養環境為晝夜12 h交替，室內溫度控制在(21±2)℃，濕度控制在50%～60%，食物和水自由攝取。

2.指標觀察：(1)一般體質量。每日仔細觀察各組小鼠飲食、排便、活動及精神狀態有無異常，每日小鼠稱重并做記錄，以周為單位統計體重增長的組間差異(將小鼠放入燒杯置于電子天平上稱重，待天平穩定后迅速讀數。若有小數位，則按照“四舍五入”原則修約)。(2)血清激素水平測定。小鼠持續BPA處理28天后，麻醉后小鼠框內靜脈取血，所取血液樣品于4 ℃靜置3 h，低溫離心機內4 ℃(3000 r/min)離心15 min，用移液槍取上清液，ELISE試劑盒(購于武漢華聯科生物有限公司)檢測血清AMH及E2激素水平。

3.熒光定量PCR法：檢測卵巢組織中AMHmRNA的表達。卵巢組織取出后投入液氮罐中凍存，各組小鼠處理完畢后將卵巢組織取出，Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度得到可用樣本。設計并合成引物，引物序列見表1。逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，在MX200096孔熒光定量PCR板中，每孔依次加入以下反應體系：cDNA 1 μl、SYBR Rremix Ex TaqTM(2X) 12.5 μl、PCR Primer(R+F) 1 μl、ROX Refence Dye 2(50X) 0.5 μl、dH2O 10 μl,總PCR體系為25 μl。按照下述條件進行擴增：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。得到各組目的基因與內參基因的Ct值，按2-△△CT法[5]計算待測目的基因表達量。

表1 熒光定量PCR的引物序列

4.免疫組織化學法：檢測卵巢組織AMH蛋白的表達。處死小鼠后快速獲取卵巢并去除周圍脂肪組織，卵巢組織經4%多聚甲醛固定24 h后，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋，間斷均勻切片，應用免疫組化試劑盒染色并鏡檢拍照，分別選擇5個不同視野進行評分。評分標準如下。染色面積:著色細胞<5%為0分；5%～25%為1 分；25%～50%為2分；50%～75%為3分；>75%為4分。染色強度：沒有著色為0分；淡黃色為1分；棕色為2分；深棕色為3分。綜合得分=染色面積得分×染色強度得分。

結 果

一、不同濃度BPA亞慢性暴露對小鼠體質量的影響

各組灌胃期間小鼠精神狀態佳，飲食、排便及活動均無異常。各組小鼠體重每周體重均呈增長趨勢，BPA低、高劑量組體重增長較緩慢，差異無統計學意義，見表2。

圖1 不同濃度BPA亞慢性暴露對小鼠體重的影響(周)

組別例數第1周第2周第3周第4周對照組1616．50±0．6417．98±0．5119．47±0．7220．82±0．72BPA低劑量組1617．09±0．4418．47±0．6119．57±0．4820．30±0．72BPA中劑量組1616．80±0．7118．58±1．0119．76±0．8320．89±0．59BPA高劑量組1616．87±0．5218．64±0．5519．02±0．5620．47±0．77

二、4組血清AMH、E2激素水平的影響

BPA處理組小鼠血清AMH及雌激素(E2)激素水平均低于對照組，BPA低、高劑量組下降顯著，差異有統計學意義，見表3，圖2。

三、4組AMH mRNA表達的影響

BPA處理組卵巢組織中AMH mRNA表達低于對照組，BPA低、高劑量組下降顯著，差異有統計學意義，見表3、圖3。

四、4組AMH蛋白表達的影響

BPA處理組小鼠卵巢組織中AMH蛋白表達與其mRNA表達趨勢一致，AMH蛋白表達顯著低于對照組，BPA低、高劑量組下降顯著，差異有統計學意義，見表3、圖4。AMH主要表達于卵泡腔內，極少表達于卵泡間質(圖5)。

表3 4組AMH激素水平、雌激素、AMHmRNA及蛋白的表達

圖2 4組血清激素水平比較 A.血清AMH; B.血清E2濃度。*P<0.05

圖3 4組卵巢AMH mRNA表達比較 *P<0.05

圖4 4組AMH蛋白表達比較 與對照組比較，*P<0.05

隨著塑料制品的廣泛使用，人群BPA暴露非常普遍。流行病學表明，超過90%的個體尿液中可以檢測到BPA,廣泛暴露于BPA對雌性生殖系統存在一定的影響[6-7]。美國環境保護署1988年首次確定50 μg/(kg·d)為人群BPA的安全參考劑量[8]，到目前依然沿用此標準。然而，安全劑量是否對所有組織器官均無毒害作用值得深思。目前文獻報道，BPA在相關實驗中的應用劑量相差較大，各研究階段在種屬、劑量等方面均不同，導致研究結果也存在一定的差異[9-12]。為了能夠更加準確地反映BPA對雌性卵巢儲備的劑量效應，選擇美國環境保護署規定的安全劑量，針對性探索低劑量BPA亞慢性暴露對雌性小鼠卵巢儲備功能的影響，使研究結果更有參考價值。AMH是轉化生長因子B(TGF-B)超家族成員，由卵巢竇前卵泡和小竇狀卵泡的顆粒細胞分泌，在卵巢顆粒細胞上表達，是卵泡生長發育的重要調節因子，其參與生理性卵泡形成過程中重要的始基卵泡募集和優勢卵泡募集，目前認為卵巢顆粒細胞是人類AMH的唯一來源。AMH的濃度水平在整個月經周期中無明顯變化，所以可以直接用來反映卵巢的功能狀態[13]。Meczekalski等[14]研究明確指出，AMH可以作為衡量晚孕生育能力及輔助生殖妊娠結局的指標，其可以準確的評價生殖壽命。Monniaux等[15]研究證實，血清AMH激素水平可以作為評價卵巢儲備功能的可靠指標，不只可應用于人群，也可以用于其他物種。

本研究選擇剛剛進入性成熟期的小鼠，其卵巢處在產生雌性生殖作用的早期，結果顯示，BPA可以引起卵巢儲備功能下降，不僅表現在血清AMH及E2激素水平下降，基因及蛋白表達也出現明顯下調，由此證實BPA對卵巢儲備功能的影響存在非單調劑量效應作用，其呈現出明顯的“U”型效應關系，此結果與前期對BPA生殖效應的研究保持一致[16-17]。雙酚A在整個劑量范圍內存在不同的作用機制，在不同劑量范圍內有不同的作用機制占主導地位，在較低劑量時可能通過激素受體介導或拮抗產生特殊的生物效應，而劑量升高至一定程度時，雙酚A與激素受體的作用達到飽和，與受體相關的響應逐漸被抑制，至高劑量時則表現出急性毒性機制。早在2004年，Zala等[18]已明確指出，在內分泌干擾物的毒理研究中這種非單調效應關系已成規律而非特例。基礎雌激素低水平是卵巢反應性下降的預測指標，BPA能使血清雌激素水平降低，進而引起卵巢低反應。持續卵巢低反應加劇雌、孕激素水平低下，反饋性促使FSH再升高，不能刺激LH峰的出現，導致顆粒細胞萎縮、卵泡體積變小，從而阻斷卵泡的發育過程。

在哺乳動物的發育過程中AMH具有性別特異性和時間依賴性，胚胎期AMH表達缺陷可導致兩性畸形的發生。其在卵泡發育的啟動和選擇性生長中也起到重要作用，AMH在卵泡細胞中高表達，并伴隨生殖細胞的消亡而表達降低，閉鎖卵泡中AMH呈低表達狀態，因而AMH基因低表達提示原始卵泡發育為生長卵泡的過程受到影響。BPA慢性暴露后小鼠卵巢組織AMH的表達下降，說明BPA可以加速小鼠卵巢顆粒細胞的凋亡過程，促使多數卵泡發生閉鎖。研究證明，BPA可影響顆粒細胞激素分泌及減數分裂過程，加速卵巢顆粒細胞的凋亡，進而引起發育卵泡的閉鎖[19-20]。Durlinger等[21]研究表明，AMH缺失型小鼠比同窩出生的野生型小鼠多了近3倍的小卵泡，卵巢內的始基卵泡隨著小鼠的生長而耗竭。在人卵巢組織中，出生時約有200萬個卵泡，到青春期時卵泡數量約30萬個左右，而在婦女生育期內可正常發育并完成排卵的卵泡只有400～500個，因此，卵巢中只有一小部分卵泡可以發育成熟并完成排卵，而大多數卵泡均退化閉鎖，以致卵泡細胞缺乏再生能力，最終導致生育功能減退。BPA可能通過干預生殖細胞的減數分裂過程而加速顆粒細胞凋亡及卵泡的閉鎖，使AMH呈現低表達狀態。而AMH缺乏，始基卵泡也將以更快的速率被募集,導致始基卵泡池提前成熟耗竭，使生殖壽命縮短。

綜上所述，亞慢性暴露于低劑量雙酚A即可導致成年小鼠卵巢儲備功能下降。但BPA對小竇狀卵泡的數量及各級卵泡構成等影響還有待進一步研究。

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