槲皮素對PM2.5發育毒性的拮抗作用

馮金秋 范愛琴 劉偉 張敏佳 周雅琳 劉坦 許雅君

近年來，我國霧霾污染加重。2013年1月，我國出現了持續大規模的霧霾天氣，覆蓋范圍涉及了17個省市自治區，約占國土面積的1/4[1]。2014年2月，我國中東部發生的霧霾污染影響面積達143萬平方公里，約占全部國土面積的1/7[2]。2015年全年，我國爆發了高達11次大范圍、持續性霧霾污染，在某些地區PM2.5峰值濃度甚至超過1000微克/立方米[3]，極大地影響了人們的生活與健康。

目前已經有相關研究發現，孕期一定劑量的PM2.5暴露會增加出生缺陷的發生風險。Agay-Shay等[4]的隊列研究結果表明，PM2.5與嬰兒孤立性動脈導管未閉有關。苑曉燕[5]研究結果顯示，PM2.5有體外胚胎發育毒性。但有關PM2.5發育毒性的機制研究卻非常少，有效干預措施的研究更是寥寥無幾。

大量研究表明，PM2.5主要毒性機制之一涉及其進入機體后對組織細胞的氧化損傷作用。PM2.5除自身帶有活性氧(Reactive oxygen species，ROS)成分外[6-7]，還能刺激細胞產生大量ROS和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)物質[6]，因而可使機體內氧化損傷加重。另一方面，PM2.5暴露可引起超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性降低[8]，從而使細胞內的ROS或RNS含量增加。推測，造成母體ROS或RNS含量的增加都可能是PM2.5發育毒性的機制之一，那么安全劑量的抗氧化活性物質可能對于PM2.5的發育毒性具有一定的拮抗作用。

槲皮素是廣泛存在于人類天然食物中的一類多酚類植物化學物，具有較強的自由基清除功能[9]，對超氧陰離子有直接或間接的清除作用，進而達到保護細胞免受各種不良因素的損傷，發揮其抗炎、抗纖維化、調節免疫功能、抗腫瘤、抗氧化等作用[10-11]。同時，它相對安全無毒，1982年，Willhite[12]就曾報道大鼠整個孕期服用2～2000 mg/kg槲皮素對胎兒均沒有明確的致畸作用，提示其用于孕期的安全性。因此，本實驗擬通過體內實驗評價PM2.5的胚胎發育毒性并探究槲皮素對PM2.5發育毒性的拮抗作用，同時設置抗氧化活性被廣泛認可的VC對照組，以期為有效地預防和控制PM2.5對人類的發育毒性提供科學依據。

對象與方法

一、對象

1.實驗材料：槲皮素(購自Sigma 公司，純度≥95%)。

PM2.5采集和制備：采用TH-150C型號智能中流量(TSP)采樣器(天虹智能儀器表廠，武漢)進行PM2.5采集，采樣時間為2014年11月15日—2015年3月15日，采樣地點位于北京市海淀區學院橋附近某建筑，采樣高度為15 m(附近無高大建筑物阻擋)，采樣流量設置為0.1 m3/min，顆粒物采集于石英濾膜上。石英濾膜在采樣前和采樣后分別恒溫干燥24 h，稱重。用滅菌手術剪將載有顆粒物的石英濾膜剪成3 cm×4 cm大小，加入超純水，水浴超聲震蕩20 min，加冰保持水溫在20 ℃以下，重復3次，收集洗脫液，并用6層滅菌紗布過濾。真空冷凍干燥后，用無菌PBS配制成不同濃度貯備液，-20 ℃避光保存。空白對照組的滴注液直接用干凈的濾膜進行上述洗脫操作。

2.實驗動物與分組：健康成年SPF級雌性ICR小鼠，體重(30±2)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]。動物飼養在屏障環境，溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，晝夜照明時間為12 h:12h。動物適應性喂養1周后按體重，隨機分為6組，空白對照組、PM2.5模型對照組、槲皮素低(50mg/kg)、中(100mg/kg)、高(200mg/kg)三個干預劑量組和VC干預組(100mg/kg)，每組10只。實驗期間動物自由飲水和進食。槲皮素劑量的確定是參考既往中英文文獻中槲皮素在孕鼠中所使用的干預劑量。

二、方法

1.實驗操作：雌鼠隨機分組后，每天晚上18:00將雌鼠與健康SPF級性成熟雄鼠1:1合籠，第2天早上7:00分籠并檢查陰栓，見栓即認為受孕，定為孕期第0天( gestational day 0，GD 0)，所有雌鼠均受孕時停止合籠。已確定懷孕的雌鼠單籠飼養，并飼喂繁殖期飼料，每天觀察孕鼠有無嗜睡、煩躁、行動不便、陰道流血等異常情況出現。孕3、6、9、12、15天稱體重，并記錄食物消耗量。

PM2.5染毒：各組孕鼠分別于GD3、GD6、GD9、GD12和GD15上午，在3%異氟烷短效氣體麻醉下進行氣管滴注，空白對照組給予1 ml/kg干凈石英濾膜洗脫液滴注，其余各組按照1 ml/kg的體積滴注PM2.5溶液，染毒劑量為15 mg/kg。

灌胃：孕鼠自GD0～GD17，每日灌胃。空白對照組和PM2.5模型對照組給予0.15%羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃，3個槲皮素干預組分別給予50、100、200 mg/kg槲皮素灌胃，VC干預組給予100 mg/kg VC灌胃，槲皮素和VC均以0.15%羧甲基纖維素鈉作為分散系。

孕18天處死所有孕鼠。

2.母鼠血清抗氧化指標檢測：孕18天用摘眼球取血法收集孕鼠血液，靜置30 min后離心分離血清，進行抗氧化指標檢測。抗氧化指標包括過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽(GSH)，所用試劑盒均由碧云天公司生產，貨號分別為S0051和S0053，所有操作均按照試劑盒說明書進行。

3.胚胎毒性和骨骼發育檢測：收集血樣后，頸椎脫臼法處死孕鼠，迅速完整分離子宮后稱量子宮連胎重。稱重后迅速剖開子宮，記錄活胎數、死胎數、吸收胎數，稱量活胎及其胎盤重量并測量胎鼠身長和尾長，每窩取半數活胎放入Bouin's液固定，以備進行內臟畸形檢查，另外半數放入95%乙醇中固定，以備進行骨骼畸形檢查。

4.統計學處理：數據均采用SPSS 20.0軟件進行分析。其中，胚胎毒性部分和肋骨畸形的數據用χ2檢驗，枕骨骨化情況的數據采用非參數檢驗進行分析，其他數據則采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，方差齊時利用LSD法進行兩兩比較，方差不齊時采用Tamhane’s T2法進行兩兩比較。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、母鼠血清抗氧化指標

PM2.5模型對照組母鼠血清中的CAT活力顯著低于空白對照組，VC干預組和三個槲皮素干預組較PM2.5模型對照組有所改善，其中槲皮素低和中劑量組的CAT活力與PM2.5模型對照組相比，差異均有統計學意義；組間血清中GSH含量比較，差異無統計學意義；見表1。

表1 槲皮素對孕期PM2.5染毒母鼠血清中抗氧化指標的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與PM2.5模型對照組比較，#P<0.05

二、胚胎毒性

孕期PM2.5染毒對胚胎的發育和存活影響不大，未呈現明顯的胚胎毒性。各組的活胎數量、吸收胎數量和死胎數量比較，差異無統計學意義，見表2。與其他組相比，VC干預組的胚胎毒性最大。

三、胎鼠情況

PM2.5模型對照組的平均胎鼠體重顯著低于空白對照組，VC干預組和三個槲皮素干預組較PM2.5模型對照組平均胎鼠體重有所增加，槲皮素中劑量組與PM2.5模型對照組的平均胎鼠體重比較，差異均有統計學意義；PM2.5模型對照組的胎鼠身長顯著低于空白對照組差異有統計學意義；其余各組與PM2.5模型對照組相比，均有不同程度的改善，其中槲皮素中劑量組與PM2.5模型對照組比較，差異有統計學意義；組間胎盤重、胎鼠身長比較，差異無統計學意義；見表3。

表2 槲皮素對孕期PM2.5染毒母鼠胚胎毒性的影響

表3 槲皮素對PM2.5染毒孕鼠的胎鼠體重、胎盤重、胎鼠身長、胎鼠尾長的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與PM2.5模型對照組比較，#P<0.05

四、胎鼠外觀、內臟和骨骼發育情況

各組活胎胎鼠外觀檢查和內臟檢查均未發現明顯畸形。骨骼觀察結果發現，與空白對照組相比，PM2.5模型對照組胎鼠14肋骨畸形和枕骨骨化不全的發生率明顯增加，差異有統計學意義；與模型對照組相比，槲皮素三個干預組的14肋骨畸形情況得到改善，槲皮素三個干預組的枕骨骨化情況也均有明顯的改善，差異有統計學意義；此外，通過比較發現，VC干預在一定程度上增加了PM2.5所致后代骨骼畸形的發生；見表4。

表4 槲皮素對胎鼠骨骼發育的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與PM2.5模型對照組比較，#P<0.05；兩兩比較時經Bonferroni校正(α調整=0.05/15=0.0033)

討 論

研究表明，大氣中可吸入顆粒物會對胎兒的宮內發育造成一定影響。van den Hooven等[13]對荷蘭7 772名母嬰隊列研究發現，妊娠后3個月暴露于PM10和NO2可減少胎兒頭圍。施淼等[14]對畸形胎兒的病例對照研究發現，妊娠1～3個月PM10暴露濃度越高，胎兒血管畸形的危險性越高。相對于PM10，PM2.5由于其比表面積大，易攜帶大量有毒有害物質經呼吸道進入人體肺部深處及血液循環，被認為對人體產生的危害更大[15-16]。

本研究結果發現，孕期以15 mg/kg PM2.5染毒可產生一定的胚胎發育毒性，表現為胎鼠體重下降和胎鼠身長縮短。三個槲皮素干預組的胎鼠體重和胎鼠身長均較模型對照組有不同程度的增加，提示孕期膳食中補充槲皮素可以在一定程度上改善胚胎的生長發育，但這一效應在本研究劑量下并沒有呈現劑量-效應關系，而是中劑量組的改善效果整體最好，低和高劑量組均稍差，提示槲皮素在改善胚胎發育狀況存在一個最佳劑量范圍。此外，PM2.5染毒可導致14肋骨畸形的發生率增加和枕骨骨化不全程度加重。槲皮素干預后，14肋骨畸形的發生率下降和枕骨骨化不全程度得到改善，且與PM2.5模型對照組相比，三個槲皮素干預組的枕骨骨化不全程度的改善。而各組間活胎率、死胎率和吸收胎率差異無統計學意義，且活胎率均較高，這可能提示在本研究的劑量范圍內，雖然PM2.5會影響胚胎的生長發育以及具有一定的發育毒性，但由于機體具有胎盤屏障等保護機制，并不會造成較多死胎、吸收胎的嚴重后果。

ROS在PM2.5毒性過程中可能發揮重要的作用，而機體為避免受到內源性或外源性ROS的損傷，在進化過程中形成了一整套代謝的抗氧化系統，主要由酶和抗氧化劑組成，如CAT、SOD、GSH等。本實驗通過對孕鼠血清中抗氧化指標的分析發現，孕期PM2.5染毒可以使母鼠血液中的過氧化氫酶(CAT)活力顯著下降，而一定劑量的槲皮素干預，逆轉了母鼠機體的氧化應激水平，與之相應仔鼠的發育毒性也在一定程度上得到了抑制，這一結果提示PM2.5致發育毒性的機制之一可能是其引發的氧化損傷。但另一方面，本研究中只有槲皮素低劑量組和中劑量組的CAT活力顯著提高，而高劑量槲皮素干預組的抗氧化效果反而不及中低劑量組，說明槲皮素的抗氧化作用在生物體內發揮時具有適宜的劑量范圍，劑量過高時反而可能加重氧化損傷。這一點之前已有相關報道，如劉爽等[17]的研究發現乙醇染毒肝細胞用100 μmol及以上的槲皮素干預時，CAT的水平與乙醇模型組反而無差異，而在低于該劑量時抗氧化效果明顯。姚芳芳等[18]的動物實驗結果表明，當槲皮素干預劑量達到40 mg/kg和50 mg/kg時，血清SOD活性下降、MDA含量上升。

VC是公認的氧自由基清除劑，本研究選擇它作為陽性對照組。結果發現VC組的母鼠血清中抗氧化指標較PM2.5模型對照組有所改善，說明VC的抗氧化作用得以實現，但是拮抗PM2.5發育毒性的效果卻不佳，甚至在一定程度上加重了PM2.5的發育毒性。分析其原因可能是PM2.5誘導發育毒性的機制眾多，氧化損傷只是其中之一。100 mg/kg VC雖然在一定程度上拮抗了部分氧化損傷作用，但尚不足抵消其他原因導致的發育毒性，甚至由于PM2.5比表面積較大，表面攜帶的成分非常復雜[19]，包含很多無機組分和有機組份，VC本身作為一種還原性較強的化學物質，不排除其與PM2.5上的某些特殊成分發生反應，增強該成分的發育毒性甚至生成具有發育毒性物質的可能，而這些物質作用的結果不足以被VC抗氧化的保護作用抵消，整體結果表現為發育毒性不減反增的情況，但具體機制還需要待進一步探討。

綜上，本實驗結果提示，一定劑量的槲皮素可以拮抗PM2.5的發育毒性，但存在適宜的劑量范圍，并非劑量越高拮抗效果越好。在槲皮素拮抗PM2.5發育毒性的機制中，抗氧化可能發揮了一定作用，但具體作用機制尚需進一步的研究。

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7 Longhin E,Holme JA,Gutzkow KB,et al.Cell cycle alterations induced by urban PM2.5 in bronchial epithelial cells:characterization of the process and possible mechanisms involved.Particle and Fibre Toxicol,2013,10 :63．

8 Li YJ,ShimizuT,HirataY,et al.EM703 inhibit NF-κB activation induced by oxidative stress from diesel exhaust particle in human bronchial epithelial cells:importance in IL-8 transcription.Pulm Pharmacol Ther,2013,26:318-24.

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