ADA、TB-Ab在原發(fā)不孕癥合并潛伏性結(jié)核女性月經(jīng)血中的表達(dá)

徐琰琪 呂品 姜麗麗 陳秀娟

潛伏性結(jié)核(latent tuberculosis，LTBI)是宿主感染結(jié)核桿菌后，由于機(jī)體免疫力強(qiáng)，而表現(xiàn)為γ-干擾素釋放分析試驗(yàn)(TB-IGRA)陽性或結(jié)核菌素試驗(yàn)(Tuberculin skin test, TST)陽性，但無癥狀或體征，同時(shí)又保持潛在的可被激活發(fā)病的一種亞臨床狀態(tài)。LTBI中有10%～20%可轉(zhuǎn)為活動(dòng)性結(jié)核[1]。女性生殖器結(jié)核(female genital tuberculosis, FGTB)是原發(fā)性輸卵管性不孕的常見病因之一。被感染者僅有10%發(fā)展為活動(dòng)性結(jié)核[2]，一旦妊娠或超促排卵助孕治療，潛伏性結(jié)核有可能激活發(fā)病，導(dǎo)致妊娠率低、流產(chǎn)率高，甚至危及生命。研究顯示，LTBI者的IVF-ET妊娠率明顯低于非結(jié)核性不孕癥者，且自然流產(chǎn)率較高，規(guī)范的抗結(jié)核治療能夠明顯改善卵巢儲(chǔ)備功能和子宮內(nèi)膜容受性，獲卵率也有所提高[2]。因此，生殖器潛伏性結(jié)核的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對控制病情發(fā)展、提高妊娠率、降低結(jié)核傳播率及不良后遺癥具有重要意義[3]。臨床上多數(shù)生殖器結(jié)核表現(xiàn)不典型、缺乏特異性檢查方法，早期確診率低。而生殖器潛伏性結(jié)核的診斷則更困難。鑒于結(jié)核分枝桿菌感染宿主時(shí)，外周血血清及胸、腹腔積液中ADA及TB-Ab的表達(dá)水平會(huì)升高[4-6]。本研究旨在檢測原發(fā)性輸卵管性不孕癥合并潛伏性結(jié)核感染患者的月經(jīng)血中ADA、TB-Ab表達(dá)水平。

對象與方法

一．對象

選取2014年3月—2015年10月就診于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心165例因不孕癥行輔助生殖技術(shù)助孕者為研究對象。將TB-IGRA陽性、主因原發(fā)性輸卵管因素的女性患者作為LTBI組，共131例,年齡(32.3±4.4)歲；將TB-IGRA陰性、主因原發(fā)性男方因素(男方無精子癥，極度少、弱精，女方未見異常)助孕治療的女性患者作為對照組，共34例，年齡(32.4±3.5)歲。所有入組的研究對象均為：年齡小于40歲，無活動(dòng)性結(jié)核臨床表現(xiàn)，經(jīng)影像學(xué)檢查、子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)檢查排除活動(dòng)性結(jié)核者。所有患者均充分知情并自愿簽署知情同意書。

二、方法

1.收集標(biāo)本：收集所有入組者月經(jīng)血，6 h內(nèi)在無菌條件下采用一次性無菌子宮內(nèi)膜取樣器收集的月經(jīng)血及子宮內(nèi)膜。并注意刮取宮角處子宮內(nèi)膜。收集的月經(jīng)血立即放入低速離心機(jī)中3000 r/min，離心10 min后用移液器取上清1 ml置于無熱原、無酶的EP管中，冷凍于﹣80 ℃冰箱中備用。收集的子宮內(nèi)膜立即轉(zhuǎn)移至無熱原、無酶的EP管中，冷凍于﹣80 ℃冰箱中備用。

2.ELISA法檢測ADA及TB-Ab：將標(biāo)本及試劑盒從冰箱中取出，平衡至室溫后，分別將按濃度梯度稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品及各個(gè)標(biāo)本液(其中行ADA檢測時(shí)使用標(biāo)本原液，檢測TB-Ab時(shí)用標(biāo)本稀釋液將標(biāo)本稀釋10倍)加入相應(yīng)的孔中，經(jīng)孵育、洗板、依次向各反應(yīng)孔中加入生物素化人ADA/TB-Ab抗體工作液、酶結(jié)合物工作液、TMB顯色液、終止液等過程后，放入酶標(biāo)儀中，測定各孔OD值。

3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測結(jié)核DNA含量：將子宮內(nèi)膜標(biāo)本從﹣80 ℃冰箱中取出，在生物安全柜中研磨。將研磨好的子宮內(nèi)膜組織轉(zhuǎn)移至無熱原、無酶的EP管中，加入50μl的DNA提取液，充分混勻。轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱中靜置8 h以保證充分裂解。10 000 rpm離心5 min，取上清液2μl待做PCR反應(yīng)。分別取出陰性質(zhì)控品、TB臨界陽性質(zhì)控品、TB強(qiáng)陽性質(zhì)控品，8 000 rpm離心數(shù)秒，吸取50μl至0.5 ml滅菌離心管中，加入50μl DNA提取液充分混勻，100 ℃恒溫處理10 min后，12 000 rpm離心5 min，備用。各個(gè)TB陽性定量參考品8 000 rpm離心數(shù)秒后備用。探針模式設(shè)置：Reporter Dye：FAM, Quencher Dye：TAMRA, Passive Reference：NONE, Date Collection：55 ℃，45 s。設(shè)置循環(huán)條件：93 ℃ 2 min，93 ℃ 45 s→55 ℃ 60 s→10個(gè)循環(huán)，93 ℃ 30 s→55 ℃ 45 s→30個(gè)循環(huán)。保存文件后運(yùn)行。

結(jié) 果

一、兩組月經(jīng)血中ADA、CA125、血沉水平的比較

LTBI組ADA、CA125水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩組血沉比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；見表1。

表1 兩組月經(jīng)血中ADA水平的比較

注：兩組比較，*t=20187，P=0.030；#t=10.269，P<0.001；△t=1.720，P=0.087

二、兩組月經(jīng)血中TB-Ab水平的比較

LTBI組112例行月經(jīng)血中TB-A檢查，水平為(162.91±67.52)U/ml；對照組34例，TB-Ab水平為(106.41±36.08)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.357，P<0.01)

三、兩組X線胸片檢查結(jié)果的比較

兩組X線胸片顯示有陳舊性鈣化灶者作為陽性，陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

表2 兩組X線胸片檢查結(jié)果的比較[例(%)]

四、ADA與TB-Ab的相關(guān)性

月經(jīng)血中ADA與TB-Ab呈正相(r=0.274，P=0.001)。

五、LTBI組子宮內(nèi)膜行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)核分枝桿菌DNA結(jié)果

LTBI組的子宮內(nèi)膜行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，陽性率為0.76%(1/131)。

討 論

活動(dòng)性結(jié)核因癥狀、體征明顯，且存在明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，因此，容易被及時(shí)發(fā)現(xiàn)、診斷及治療。而潛伏性結(jié)核由于病史不典型、癥狀隱匿、目前缺少特異性檢查方法，導(dǎo)致診斷甚為困難[7]。在結(jié)核低負(fù)擔(dān)國家(如美國、英國等)，TB-IGRA已被FDA批準(zhǔn)用于診斷潛伏性結(jié)核感染[7-8]。生殖器結(jié)核是不孕的重要原因，尤其在輸卵管性原發(fā)不孕患者中，生殖道結(jié)核的患病率較高。本院統(tǒng)計(jì)的原發(fā)性輸卵管性不孕的腹腔鏡檢查結(jié)果中，結(jié)核感染者占13.5%。

腺苷脫氨酶(ADA)在T淋巴細(xì)胞的增殖和分化中起到重要的作用[9-10]。因此，當(dāng)機(jī)體的細(xì)胞免疫被激活時(shí)，如患傳染性單核細(xì)胞增多癥、傷寒、結(jié)核病時(shí)，T淋巴細(xì)胞數(shù)目增加，導(dǎo)致ADA表達(dá)水平升高。有研究表明，結(jié)核患者，包括菌陰肺結(jié)核患者血清ADA水平顯著高于肺炎、肺癌、正常者的ADA水平[11]。盡管ADA水平在結(jié)核病患者體內(nèi)較正常人高，但ADA不能夠作為區(qū)分肺結(jié)核和其他部位結(jié)核感染的合適指標(biāo)[12]。本實(shí)驗(yàn)通過ELISA法直接檢測ADA在月經(jīng)血中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示LTBI組ADA水平明顯高于對照組。由于月經(jīng)血直接取自患者宮腔，無外周血的檢測，月經(jīng)血ADA表達(dá)水平升高對于生殖道結(jié)核感染的臨床意義還需進(jìn)一步研究。

結(jié)核抗體(TB-Ab)是機(jī)體對感染的結(jié)核分枝桿菌發(fā)生反應(yīng)所產(chǎn)生的一種特異性免疫球蛋白，因而具有高度特異性，尤其在菌陰性結(jié)核分枝桿菌感染者中的靈敏度較高。本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)時(shí)，將外周血TB-IGRA檢測結(jié)果為陽性的患者作為LTBI組，由于TB-IGRA檢測結(jié)果不受卡介苗接種或非結(jié)核分枝桿菌感染等因素的干擾，因此，TB-IGRA結(jié)果陽性，提示體內(nèi)存在結(jié)核分枝桿菌的感染。在此基礎(chǔ)上再行TB-Ab水平的檢測，可除外檢測結(jié)果因接種卡介苗而出現(xiàn)假陽性的可能。其次，實(shí)驗(yàn)標(biāo)本直接取自患者的生殖器—子宮腔。通過ELISA法直接檢測患者月經(jīng)血中TB-Ab水平，顯示LTBI組TB-Ab水平明顯高于對照組。由于無外周血的檢測，月經(jīng)血TB-Ab表達(dá)水平升高對于生殖道結(jié)核感染的臨床意義還需進(jìn)一步研究。

ADA和TB-Ab在原發(fā)性不孕癥合并潛伏性感染者體內(nèi)的表達(dá)水平均升高，兩者正相關(guān)。其原因有可能是，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體時(shí)，會(huì)激活體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫，導(dǎo)致ADA和TB-Ab同時(shí)升高。

血清CA125在活動(dòng)性結(jié)核患者體內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)，而經(jīng)抗結(jié)核藥物治療后，CA125的水平降至正常范圍[13]。本文通過分析對比LTBI組與對照組血清CA125值發(fā)現(xiàn)，潛伏性結(jié)核感染組者血清CA125表達(dá)水平高于非潛伏性結(jié)核感染組，兩組數(shù)值均在正常范圍值之內(nèi)，分析其原因可能與結(jié)核處于非活動(dòng)狀態(tài)有關(guān)。因此，外周血中CA125水平升高提示炎癥的存在，對于生殖器的結(jié)核性炎癥有輔助的診斷意義。

X-線胸片檢查是診斷肺結(jié)核的常用輔助檢查方法。在肺外結(jié)核患者的診斷中，僅具有參考意義。

在有臨床根據(jù)的高度懷疑有結(jié)核存在的不孕癥女性中行子宮內(nèi)膜結(jié)核分枝桿菌PCR實(shí)驗(yàn)，57%的患者呈現(xiàn)陽性，而在無臨床根據(jù)懷疑結(jié)核存在的不孕癥者女性中，僅有9.5%的患者呈現(xiàn)陽性[14]。這可能與生殖器結(jié)核首要影響的部位是輸卵管，其次是子宮內(nèi)膜，而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜中結(jié)核分枝桿菌含量極少有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測子宮內(nèi)膜中結(jié)核分枝桿菌的結(jié)果顯示陽性率極低。分析其有可能存在的原因：(1)高度懷疑潛伏性生殖器結(jié)核女性子宮內(nèi)膜中結(jié)核分枝桿菌通常含量較少，且組織標(biāo)本中結(jié)核桿菌不易暴露[15]，而本次實(shí)驗(yàn)取材量較少，采樣的位置或許并不能代表結(jié)核感染的區(qū)域，結(jié)核感染的區(qū)域有可能因結(jié)核分枝桿菌的稀疏分布而錯(cuò)過；(2)子宮內(nèi)膜呈周期性脫落，肉芽腫沒有足夠的時(shí)間形成[16]。因此，對原發(fā)不孕癥合并潛伏性結(jié)核患者查子宮內(nèi)膜結(jié)核桿菌DNA還需要進(jìn)一步探索。

總之，原發(fā)不孕癥合并潛伏性結(jié)核感染的女性患者月經(jīng)血中ADA及TB-Ab水平高。原發(fā)不孕癥合并潛伏性結(jié)核感染的女性患者子宮內(nèi)膜結(jié)核分枝桿菌陽性率很低，需要進(jìn)一步探索潛伏性結(jié)核者子宮內(nèi)膜結(jié)核菌DNA的篩查方法。

1 World Health Organization:Global tuberculosis control:epidemiology，strategy，financing:WHO report 2009.Geneva，Switzerland:World Health Organization，2009.

2 Dam P，Shirazee HH，Goswami SK，et al.Role of latent genital tuberculosis in repeated IVF failure in the Indian clinical setting.Gynecol Obstet Invest，2006，61:223-227.

3 Jain K，Jain B.ART outcome in genital tuberculosis in Indian population-a prospective study．ASRM Abstracts，2013，10：1216.

4 尉艷霞，童朝暉，龔娟妮，等.腺苷脫氨酶診斷結(jié)核性胸膜炎價(jià)值的再評價(jià)．中國結(jié)核和呼吸雜志，2010，33:273-275.

5 Riquelme A，Calvo M，Salech F，et al.Value of adenosine deaminase(ADA)in ascitic fluid for the diagnosis of tuberculosis peritonitis:a meta-analysis.J Clin Gastroenterol，2006，40:705.

6 何丙生，代秀萍，李雙初，等.腺苷脫氨酶、結(jié)核抗體及DNA聯(lián)合檢測在結(jié)核性積液的臨床診斷價(jià)值.武漢大學(xué)學(xué)報(bào)，2012,33:544-546.

7 Mazurek GH，Jereb J，Lobue P，et al.A guideline for using the QuantiFERON-TB Gold test for detecting Mycobacterium tuberculosis infection，United States.MMWR Recomm Rep，16，54:49-55.

8 Lalvani A.Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century:new tools to tackle an old enemy.Chest，2007，131:1898-1906.

9 Farazi A，Moharamkhani A，Sofian M.Validity of serum adenosine deaminase in diagnosis of tuberculosis.Pan Afr Med J，2013，15:133.

10 Russo M，Giancane R，Apice G，et al.Adenosine deaminase and purine nucleoside phosphorylase activities in peripheral lymphocytes from patients with solid tumors.Br J Cancer，1981，43:196-200.

11 Shokrollah Salmanzadeh，Heshmatollah Tavakkol，Khalid Bavieh，et al.Diagnostic value of serum adenosine deaminase (ADA) level for pulmonary tuberculosis.Jundishapur J Microbiol，2015，8:e21760.

12 Bolursaz MR，Khalilzadeh S，Khodayari A，et al.Adenosine deaminase level as an indicator for differentiating between active pulmonary tuberculosis infection and other pulmonary infections.J Compr Ped，2012,3:3-6.

13 Yilmaz A，Ece F，Bayramgürler B，et al.The value of Ca 125 in the evaluation of tuberculosis activity.Respir Med，2001，95:666-669.

14 Thangappah RB，Paramasivan CN，Narayanan S.Evaluating PCR，culture & histopathology in the diagnosis of female genital tuberculosis.Indian J Med Res，2011，134:40-46.

15 高綠芬，羅新.女性盆腔及生殖器結(jié)核特征的再認(rèn)識(shí)．中國實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2008,24：262.

16 Kapoor N，Pawar S，Sirakova TD，et al.Human granuloma in vitro model，for TB dormancy and resuscitation.PLoS One，2013，8:e53657.