KRAS基因突變與結直腸癌的研究進展

范志軍

【摘要】 結直腸癌作為高發的惡性腫瘤，國際醫學界一直致力于結直腸癌的治療研究。惡性腫瘤靶向治療藥物的問世，結直腸癌也開始應用靶向藥物進行治療，臨床治療顯示，KRAS基因突變與用于結直腸癌單抗EGFR的臨床療效具有較大的關聯，國際上醫學已經開始把KRAS基因突變作為是否采用EGFR單抗的重要檢驗指標。因而有效的檢測KRAS基因突變，具有較高的醫學價值。

【關鍵詞】 結直腸癌； KRAS基因突變； 靶向治療； 單抗

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.8.093 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2017）08-0163-02

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一，發病率和病死率均位于惡性腫瘤的第3位，KRAS基因長約35 kb，位于12號染色體，編碼K-ras蛋白，參與表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號傳導過程，是CRC研究中最受關注的基因突變之一。有研究顯示，KRAS基因突變對CRC患者預后有不同的影響，且不同的位點突變也與之相關。已有許多研究者針對此問題進行了系統評價，KRAS基因是CRC研究中最受關注的基因突變之一，能增加CRC患者的死亡風險和疾病進展風險，可能是影響CRC患者預后的危險因素。

1 KRAS基因突變的研究

所有的RAS基因里面，KRAS與人類的患癌率直接相關，KRAS基因在人體內相當于腫瘤患病的開關，它較大程度地影響著人類的細胞生長[1]。正常情況下的KRAS基因可以有效地抑制腫瘤細胞的生長，但是KRAS基因一旦出現突變，就會不斷地刺激細胞的生長，擾亂細胞的正常生長，從而引發機體的腫瘤細胞的繁殖[2-3]。直腸癌患者的KRAS基因與腫瘤發病原理具有較大的相關性，臨床數據表明，結直腸癌患者的KRAS基因突變概率高達30%～40%[4-5]。

KRAS基因突變的出現在結直腸癌的早期，這時患者的原發灶與轉移灶的KRAS基因能夠保持較大的一致[6-7]。在臨床治療過程中，KRAS基因不會因治療過程而出現突變。但是KRAS基因會出現點的突變，突變的位點主要集中在二號外顯子里的12-13密碼子，以及三號外顯子的61密碼子[8-9]。在直腸癌患者的臨床治療過程中，KRAS基因突變的檢出率高達90%以上，這個結果表明，KRAS的基因突變檢測非常具有醫學價值[10]。

2 KRAS基因突變的檢測

2.1 突變的檢測

KRAS基因突變成為當代醫學生命研究的熱點課題之一，突變的檢測手段也得到了不斷的發展。對于基因突變的檢測，20世紀80年代之前，主要采用了Southern印跡法，能夠有效地檢測出基因的重組、缺失、亂碼、增多等主要突變情況。但是Southern印跡法無法較好的用于基因突變的檢出，因而在較長一段時間使用較為費時的DNA序列檢測分析法。21世紀研究得到的多聚酶鏈式反應技術使得基因突變檢測得到了較大的進展，基因突變檢測建立在多聚酶鏈式反應技術的基礎上得到了迅速的發展[11-12]。

臨床中還采用的KRMS檢測方法，在實際中是通過引物設計和瓊脂糖電泳對突變結果進行判定的，不用借用別的器材，非常靈活方便。但對于特定位點里的設計方案，不能夠對未知的突變進行有效的篩查[13-14]。焦磷酸測序技術通過四種酶催化，促使同一反過程中的酶級聯呈現化學的發光反應，這種分析方法可以有效地檢測出SNP的存在。但在檢測過程中，需要對于檢測樣本進行PCR擴增、跑膠、切膠進行純化后才能測序，操作步驟復雜，檢測成本較高，檢測結果的準確率也不高，不適用于大樣本的多位點檢測[15]。此外，研究發現的HRM檢測方法可以實時對熒光進行定量檢測，也在多聚酶鏈式反應技術基礎之上，對飽和染料監控核酸曲線變化進行基因分析的主要方法之一。

HRM需要在實時監測過程中對雙鏈DNA熒光染料與多聚酶鏈式反應技術產物相結合來有效的對基因進行突變檢測，HRM在檢測過程中，必須要使用到序列特異性探針，這樣才能夠不受突變堿基位與種類的限制，可以在使用多聚酶鏈式反應技術之后，直接根據檢測結果進行熔解曲線分析，在檢測過程中，具有快捷方便、節約成本、結果準確等優點[16]。而HRM技術不會對DNA造成損傷，可以在結果分析后直接進行純化測序。HRM分析手段可以有效的對基因突變進行檢測，可以迅速對突變進行掃描，以及基因的序列匹配，能夠在臨床中對基因突變進行有效的檢測[3-4]。

2.2 檢測適用范圍

KRAS基因突變的檢測適用較為廣泛，檢測過程中患者的血液、穿刺標本、石蠟包埋手術標本都能夠作為有效的樣本，當前，很多檢測樣本都需要進行石蠟包埋。可是，近幾年發現，采用的石蠟標本提取的DNA檢測質量較低，在石蠟標本里檢測出的KRAS基因突變率比冰凍組織標本的檢出率少一半左右[17]。使用福爾馬林會較大程度地破壞DNA雙鏈結構，使得傳統的多聚酶鏈式反應技術與之發生反應，形成后期的基因突變。要是腫瘤細胞的數目大于300個，或者是DNA模板的數量大于30 ng，則可以較好的避免這種情況的出現[5-6]。

非腫瘤細胞會較大程度地干擾KRAS突變基因的檢測，要是在顯微鏡下進行選擇性的抽提，就會有效地提高檢測的敏感性。一般來說，對于腫瘤細胞的靈敏度檢測必須要高于70%以上，有文獻[18]報道認為，外周血的KRAS基因突變檢測之后，顯示出對腫瘤具有較高的侵襲性，可以有效地預防后期的不良狀態發生。血液里標本顯示的低濃度的DNA，檢測的敏感性較低，不利于臨床應用，而外周血與腫瘤的原發灶、轉移灶一致的問題還沒有明確的定論，需要醫學專家進一步的確定。

3 KRAS基因突變對臨床治療的意義

結直腸癌在臨床治療過程中，KRAS基因突變與EGFR抗體療效具有較大的相關性，臨床中通常采用了檢測KRAS基因突變的方法，以較好的確定患者在治療中EGFR抗體的使用情況。KRAS基因野生型者可以在EGFR抗體的使用中得到更好的臨床療效，在美國臨床雜志上更新的結論也同樣支持了這一說法[19]。

臨床研究表明，KRAS突變檢測可以較好地指導西妥昔單抗的臨床應用，臨床治療過程中可以把西妥昔單抗與FOLFOX4聯合用于惡性腫瘤的治療中，可以更為顯著地提高患者的臨床療效。通過對患者的KRAS突變進行有效分析，KRAS突變型患者在聯合治療中無明顯療效，而KRAS野生型患者中使用聯合治療具有較好的療效[20]。檢測KRAS基因突變的過程中，可以有效地幫助院方登記觀察患者的臨床情況，在治療中，采用科學適用的方法對患者進行臨床治療。西妥昔單抗聯合伊立替康一線治療轉移性結直腸癌的CRYS-TALⅢ期研究已經證實，在意向治療人群（ITT）中，FOLFIRI聯合西妥昔單抗方案可以提高患者一線治療客觀有效率（ORR）和無進展生存期（PFS）[21]。

綜上可知，KRAS基因突變情況與直腸癌單抗治療結果密切相關，檢測結果可以作為患者的有效治療指標，通過檢測結果也能夠選擇較為合理的治療方法與靶向藥物，以更好的實現惡性腫瘤的差異化治療。這種人性化的治療方法，可以更好地為患者節約更多的經濟開支，分子靶向治療也是治療腫瘤的發展趨勢。對于KRAS基因突變檢測的意義已經得到了醫學界的廣泛認同，但是在國際醫學中還沒有明確的標準化檢測方法，HRM檢測分析方法在近年來開始逐漸發展起來，并在多個檢測領域里得到了較好的應用，應該會在不久的將來成為臨床KRAS基因突變檢測的常規方法。

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（收稿日期：2016-11-15）