腫瘤特異性成像中固相萃取對Gd-DOTAOCT小分子探針構建的影響

霍天龍，楊碩，孫燕萍，潘峰，胡立寶，康鈺，趙赟赟

北京大學人民醫院 放射科，北京100044

腫瘤特異性成像中固相萃取對Gd-DOTAOCT小分子探針構建的影響

霍天龍，楊碩，孫燕萍，潘峰，胡立寶，康鈺，趙赟赟

北京大學人民醫院 放射科，北京100044

目的探討“一步法”構建Gd-DOTA-OCT小分子MR探針，并用固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）對其進行分離。方法采用商品化DOTA-OCT直接用GdCl3螯合，并用SPE進行分離和提純，對分子探針進行紫外分光光度檢測、質譜檢測和MR信號檢測。結果“一步法”可以成功合成Gd-DOTA-OCT，并用SPE進行成功分離，經質譜檢測與理論分子量相同，紫外分光光度法檢測探針和MR信號檢測證明分子探針完整。結論Gd-DOTA-OCT小分子探針可以用一步法成功構建，并可用SPE方便地進行分離和純化，為腫瘤特異性成像奠定基礎。

分子成像；分子探針；固相萃取；質譜檢測；Gd-DOTA-OCT；MR信號檢測

分子影像學是多種影像技術交叉和多種學科融合的前沿學科，它針對發生病變的細胞或分子進行成像，目前已迅速成為最具魅力和活力的影像領域，有望在多種疾病的早期診斷，尤其是癌癥和神經退行性疾病的早期診斷方面發揮巨大作用[1]。在多種成像方式中，MR因其兼具有組織分辨力高和相對敏感的特點而成為分子影像研究和突破的熱點。

分子成像的關鍵是分子探針構建。分子探針的構建基礎是特異性分子的選擇，即針對發生病變的靶組織和靶分子設計特異性探針。圍繞特異性分子，在雙功能連接劑存在或特異性分子直接與成像核耦合，即可構建特異性分子探針。

構建簡單、性質穩定的分子探針是獲得最佳成像效果的重要前提，本研究遵循分子探針構建模式，選擇奧曲肽（Octreotide，OCT）作為特異性分子，與穴窩狀的雙功能連接劑 DOTA（四氮雜環十二烷）進行偶聯后，用GdCl3標記，通過SPE分離標記物，可得到MR分子探針，為下一步成像奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 探針合成

準備商品化的DOTA-OCT（分子量1422，上海默息生物），每次將5 μmol DOTA-OCT溶于10 mL 0.2 mol Tris-HCl（pH 6～7）緩沖液中，將上述液體加熱（水浴 60℃）10 min；取分析純過量GdCl3（北京國藥）10 μmol以上，加入溶液中，室溫靜置120 min，待螯合完全后進行分離。

1.2 探針分離

采用固相萃?。⊿olid Phase Extract，SPE）方法進行探針分離。Sep Pak C-18固相萃取小柱（Waters，USA），上樣容積6 mL。上樣前活化，用5 mL 無水乙醇（北京國藥集團，分析純）、5 mL生理鹽水和5 mL空氣依次過柱，反應混合物上柱前經過Na2HPO4沉淀，超速離心去沉淀后將上清液上柱，用1.5 mL Ep管收集液體，每管1 mL，用負壓抽吸泵調（圖1）至流速1 mL/s；然后用5 mL生理鹽水對小柱進行淋洗，每管收集1 mL；最后用80%無水乙醇（無水乙醇加雙蒸水稀釋）洗脫小柱，每管1 mL收集洗脫液體，保持流速1 mL/s。各管進行編號以備檢測。

圖1 固相萃取負壓抽吸裝置

1.3 繪制分子探針洗脫曲線

使用紫外分光光度法檢測各組分。將SPE過柱后各組分分別用紫外分光光度計（TU-1901）檢測，用260 nm進行光度掃描，測量3次，取平均值。利用各組分A260 nm數據繪制分子探針洗脫曲線。

1.4 質譜檢測

將商品化DOTA-OCT 100 μg（理論分子量 1422），加蒸餾水200 μL溶解，取100 μL進行MAITI-TOF檢測。再取100 μL分離后分子探針，進行MAITI-TOF檢測。質譜檢測由北京大學醫學部中心實驗室有機質譜室完成。

1.5 MR 信號檢測

將SPE后各組分在1.5 mL Ep管內進行MR（MR750w，GE 公司）信號檢測，樣本固定在Ep管專用塑料管架中，各組分按照收集順序擺放，圖2。采用膝關節線圈掃描，掃描參數：常規T1WI和T2WI掃描，FOV 24 cm，層厚2 mm，間距0.2 mm。

圖2 分子探針各組分MR信號檢測擺放草圖

2 結果

2.1 探針構建

按照標準步驟，用“一步法”可以簡便、穩定和可重復性地合成Gd-DOTA-OCT。

2.2 探針紫外檢測結果

用260 nm檢測分組分紫外分光光度值，結果見圖3。

圖3 各組分紫外分光光度檢測結果條形圖

2.3 探針質譜檢測結果

商品化的 DOTA-OCT理論分子量為1422，預先檢測DOTA-OCT完整性，用MOLTI-TOF實際檢測為分子量1421（圖4A），證明DOTA-OCT完整。Gd原子量為157，Gd-DOTA-OCT理論分子量為1579，經MOLTI-TOF質譜檢測，Gd-DOTA-OCT 實際分子量最高頻度值為1576，與理論分子量符合（圖4B）。

2.4 MR信號檢測

MR掃描顯示，各組分各管的MR信號表明，洗脫組分含有較多的Gd組分，見圖5。

參照擺放草圖，從左到右為分別為上樣組分、鹽洗組分和洗脫組分，從上到下為樣本編分別為1～5，1～10，1～15。從圖可以看出，上樣組分MR信號較高，提示含有較高濃度的；鹽洗組分開始MR信號較高，第10管信號減低很明顯，提示Gd成分明顯減少；洗脫組分MR信號又開始增高，提示Gd成分再次增多，增高趨勢和紫外分光光度結果一致（檢測OCT成分），說明洗脫組分既含有較高濃度Gd，又含有較高濃度OCT，因此再次證明洗脫組分含有Gd-DOTA-OCT 分子探針。

圖4 質譜檢測圖

圖5 SPE后各組分MRT1W掃描圖像

3 討論

3.1 Gd-DOTA-OCT分子探針構建策略

分子探針的構建是分子成像的關鍵和前提條件。根據Gd3+化學性質，采用化學選擇性策略，將雙功能螯合劑DOTA的一端和針對SSTR的特異性分子OCT進行偶聯，然后用Gd3+螯合標記，可形成穩定的Gd-DOTA-OCT螯合物，即特異性MR分子探針。理論上，用于成像的Gd具有MR成像能力，而且金屬離子不直接與特異性分子相連，不改變其分子結構，不會影響特異性分子與相應受體的結合。

3.2 Gd-DOTA-OCT MR 探針信號檢測

對分子探針進行體外 MR 信號測量是驗證探針是否有效的必要措施。本研究對純化的分子探針進行了檢測。體外信號的強弱可以推測體內成像效果。小分子容易通過體內轉運屏障到達靶組織，因此，在構建分子探針時，小分子要比大分子更優越。Gd類探針分子量較小，有利于體內尋靶。

探針是否能夠產生可見的MR信號是實驗的關鍵。MR信號強弱與Gd含量相關。本研究中，上樣組分的的MR信號稍高，說明含有Gd3+成分。游離的Gd3+不被C-18柱保留，因此上樣組分中游離Gd3+含量的多少直接與反應后未螯合Gd3+含量的多少相關。本實驗反應前GdCl3過量不多，混合物游離Gd3+成分較少，因此上樣組分MR信號增高不明顯。鹽洗組分游離Gd3+含量極微，MR信號不高。從上樣到鹽洗，各樣本信號變化不大。80%乙醇洗脫組分MR信號明顯變化，原液的信號極低（尤其是第1和第2洗脫管），而1:50的稀釋液信號非常高。根據前期馬根維顯稀釋實驗結果，說明Gd成分非常多-與上樣組分和鹽洗組分不同的是，這些Gd成分不再是游離的Gd3+，而是螯合態的Gd，即Gd-DTPA-OCT。因此，通過SPE分離后MR信號的檢測，證明80%乙醇洗脫組分內含有大量分子探針。

3.3 Gd3+的安全性和應對策略

與螯合狀態的金屬離子不同，游離的Gd3+有毒，如何減低或避免游離Gd3+產生關系到分子探針在體內是否安全。Gd類對比劑作為非特異性細胞外對比劑，已廣泛應用于臨床。但近年來發現，某些Gd類對比劑可導致腎源性系統纖維化/腎源性皮膚硬化癥（NSF/NSD）[2-3]。通常認為當腎功能不全時，對比劑排泄緩慢，加上酸中毒，離子交換，使Gd3+大量解離，沉積在組織間隙內，引起組織廣泛纖維化。螯合劑，即linker的選擇非常重要。螯合劑一方面穩定螯合金屬離子，減輕毒性，另一方面避免金屬離子直接與特異性多肽相連，以免影響多肽生理活性?，F階段常用的螯合劑中，DOPA是個穴窩狀化合物，DOTA 作為一種環形配體較DTPA等線性配體螯合穩定常數更大，它的螯合物最穩定，因而使螯合的Gd不易解離。有關對比劑使用的臨床大量統計資料表明，在常用的8種Gd類對比劑中，以DOTA作為螯合劑的對比劑，目前還沒有收到NSF相關報告[4]。因此，DOTA等環狀雙功能螯合劑是目前構建分子探針的最佳選擇。即便如此，在合成分子探針時應采取以下措施增加分子探針安全性：① 在合成螯合物時，Gd3+是過量的，這樣有利于充分螯合，但Gd3+不能過量太多；② 分離純化時，一定要充分洗脫游離的Gd3+。

3.4 特異性分子的選擇-生長抑素受體

特異性分子的選擇也是研究重點，本研究選用小分子多肽，因為小分子多肽作為特異性分子，沒有抗原性，制備相對簡單，成本較低，形成的復合物分子較小，目標-本底信號比 值高，代謝快，顯像時間相對短，是構建探針的理想選擇。生長抑素是一種存在于人腦、下丘腦、胃腸、胰腺等部位內分泌細胞中的活性多肽，具有廣泛的生理作用，能抑制生長激素、消化道激素等激素的分泌，抑制胰腺和胃的外分泌，作為 中樞神經內神經遞質，還可調節正常細胞和腫瘤細胞的分化增殖，具有抗增殖作用。生長抑素在體內是通過與生長抑素受體（Somatostatin Receptor，SSTR）結合而發揮生理功能的。生長抑素受體有五種亞型（subtype），分別稱為SSTR1-5。正常情況下，SSTR表達很少。與正常組織相比，腫瘤組織SSTR表達顯著增多。大多數腫瘤如肝細胞癌主要表達SSTR2或SSTR5亞型[5]。

天然的生長抑素與所有五種亞型都具有很高的親和力，但在體內受肽酶的作用，半衰期過短（1～3 min）[6]，制約了其在臨床上的廣泛應用。OCT是一種人工合成的、由8個氨基酸組成的活性多肽，是生長抑素的擬似物，它不但保留了天然生長抑 素的藥理學活性，而且特異性更高，作用更強。與天然生長抑素不同，人工合成的生長抑素擬似物OCT與不同的亞型有不同的結合活性[7]。OCT與SSTR2和SSTR5有很高的親和力，與SSTR3的親和力較低，并且不與SSTR1和SSTR4結合[8]。

因此，利用OCT可以設計分子探針對高表達SSTR2的腫瘤進行特異性顯像。

3.5 SPE 在分子探針質量控制中的作用

分離純化是保證實驗有效的關鍵之一。文獻中多采用HPLC和SPE進行分離純化[9-14]。HPLC可以分離純化出純度很高的分子探針，帶有紫外檢測器，可以檢測組分的分離情況。SPE是一種在制藥領域廣泛應用的樣品前處理技術，它的基本原理和HPLC相同，就是利用各組分對固相支持物的結合力大小，對溶解在液相中的物質進行分離。其基本組成和HPLC一樣，是用C-18或25填料的柱芯，配以輔助裝置，如加壓器或負壓泵等，即可完成分離工作。多肽因含有疏水側鏈，因此在液體流過柱芯時，可以暫時保留在柱子上，而其他無機離子、小分子等不能或幾乎很少保留，則被淋洗下來?？梢杂脴O性弱一些的溶劑對保留有多肽的小柱進行洗脫，收集洗脫物，就可以得到想要的分子探針。紫外分光光光度法是一種常用的測量溶液中具有特定吸光度物質的方法。測量吸光度之前，可以對溶液進行光譜掃描，根據吸收曲線可以判斷吸收峰的數目、位置、相對強度以及吸收峰的。常見的物質是多肽和蛋白等大分子物質，因其內部還有共軛雙鍵，可以吸收一定波長的紫外線[15-16]。根據朗伯-比爾定律就可以估算出溶液中待測物質的含量。紫外檢測方法的優點是操作簡便、迅速、不需要復雜和昂貴的設備，不消耗樣品，測定后仍能回收使用，低濃度的鹽和大多數緩沖溶液不干擾測定。缺點：準確度和靈敏度差一點。干擾物質多，樣品中含有其他吸收紫外基團時，結果不太準確。但是可以通過嚴格的控制減少干擾。多肽和蛋白在260 nm和280 nm也有相應的較強吸收，而且在這一范圍內，小分子鹽類和有機物，如甲醇、乙醇、乙腈等干擾很小，所以測量結果更準確。一般來說，紫外分光光度法測定蛋白質的濃 度范圍為0.1～1.0 mg/mL，在這一濃度范圍內，濃度與吸光度具有良好的線性關系，測量結果比較準確。本實驗所構建的分子探針的多肽濃度在這一范圍內。采用光譜掃描的方法可以 對各組分進行檢測，以確定是否含有多肽，就可以明確分子探針在什么組分內。所以，SPE分離純化加上紫外分光光度檢測，是一個進行質量控制簡便可行的方法。

4 結論

本文給出了一種簡單、有效的MR分子構建方法，并利用SPE法對構建的多肽類小分子探針構建進行質量控制。分子探針質量控制的關鍵是構建過程簡單和方法穩定，分子探針構建的核心是分子探針質量控制，分子探針構建是分子成像的前提。因此，本研究提供的方法可以為構建其他分子探針進行分子成像奠定基礎。

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Efficacy of Brain Tumor Specific Imaging Solid Phase Extraction in the Construction of Gd-DOTA-OCT Small Molecular Imaging Probe

HUO Tian-long, YANG Shuo, SUN Yan-ping, PAN Feng, HU Li-bao, KANG Yu, ZHAO Yun-yun
Department of Radiology, Peking University Poeple’s Hospital, Beijing 100044, China

ObjectiveTo discuss the effect of “one step method” on constructing Gd-Tetraazacyclododecane-Octreotide (Gd-DOTA-OCT) small molecular MR imaging probe by adopting Solid Phase Extraction （SPE）method to isolate it from the mixture.MethodsThe commercial DOTA-OCT was chelated with GdCl3 directly, and the mixture was isolated and purified with SPE method, then all the isolated fractions were underwent ultraviolet spectrophotometric detection, mass spectrometric detection and MR signal detection respectively.ResultsGd-DOTA-OCT was synthesized with “one step method” and isolated with SPE method successfully. The actual molecular weight of the probe detected by MALTI-TOF was consistent with the theoretic molecular weight, and the Gd-DOTA-OCT MR probe was intact after being verified by the ultraviolet spectrophotometric detection and MR signal detection.ConclusionGd-DOTA-OCT small molecular MR probe can be successfully constructed with “one step method” and can be isolated and purified with SPE method, which lays a foundation for brain tumor specific imaging.

molecular imaging; molecular probe; solid phase extraction; mass spectrometric detection; Gd-tetraazacyclododecane-octreotide; MR signal detection

TP333.3；R445.2

A

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.03.002

1674-1633(2017)03-0006-04

2017-01-13

高等學校博士學科點專項科研基金新教師類（2011000 1120083）；國家自然科學基金面上項目（81372363）。

霍天龍，副主任醫師，主要研究方向為分子影像學。

通訊作者郵箱：huotianlong@bjmu.edu.cn