杠柳毒苷體外抑制胃癌細(xì)胞增殖能力的分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建研究

王炬瑋，臧文遠(yuǎn),刁 凱,劉海燕

(吉林油田總醫(yī)院 1.血液腫瘤科;2.CT科,吉林 松原138000)

杠柳毒苷體外抑制胃癌細(xì)胞增殖能力的分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建研究

王炬瑋1，臧文遠(yuǎn)2,刁 凱1,劉海燕1

(吉林油田總醫(yī)院 1.血液腫瘤科;2.CT科,吉林 松原138000)

目的 探討構(gòu)建杠柳毒苷體外抑制胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞增殖能力的分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為解析杠柳毒苷抗腫瘤作用的分子機(jī)制提供理論支撐。方法 本研究收集美國(guó)GEO公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄的所有杠柳毒苷處理胃癌SGC-7901細(xì)胞系前后的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)；通過(guò)差異表達(dá)分析獲得經(jīng)過(guò)杠柳毒苷處理后胃癌SGC-7901細(xì)胞系表達(dá)水平發(fā)生顯著性改變的基因；通過(guò)GO基因功能注釋以及KEGG代謝通路富集分析，探究杠柳毒苷作用后表達(dá)水平發(fā)生顯著性改變基因的功能；最后結(jié)合TRED數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的人類轉(zhuǎn)錄因子信息，構(gòu)建分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果 與胃癌SGC-7901細(xì)胞系相比，經(jīng)杠柳毒苷處理后的SGC-7901，其癌細(xì)胞中共有1105個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)，其中552個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，553個(gè)基因下調(diào)表達(dá)。基因功能分析顯示，表達(dá)上調(diào)基因主要參與葡萄糖代謝、鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)、鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物功能；表達(dá)下調(diào)基因主要參與同嗜性細(xì)胞粘著、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物功能。KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要參與腫瘤相關(guān)的諸多代謝通路。最后，基于差異表達(dá)基因及TRED數(shù)據(jù)庫(kù)中所收錄的人類轉(zhuǎn)錄因子信息，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分子偶聯(lián)，構(gòu)建了分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)論 基于分子共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)杠柳毒苷的作用分子機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)性挖掘。

杠柳毒苷；胃癌SGC-7901細(xì)胞系；分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；細(xì)胞增殖

(ChinJLabDiagn,2017,21:0392)

中藥香加皮(cortex periplocae)是蘿藦科(Asclepiadaceae)杠柳屬(Periploca L.)植物杠柳(PeriplocasepiumBunge)干燥處理后的根皮。味辛、苦，性溫，有毒性，可用于風(fēng)寒濕痹、腰膝酸軟、心悸氣短、下肢水腫等癥[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，香加皮正丁醇提取物杠柳毒苷(periplocin)對(duì)包括食道癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌等在內(nèi)的多種實(shí)體瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的腫瘤增殖抑制作用[2-6]。但具體作用的分子機(jī)制仍不完善，為進(jìn)一步探究杠柳毒苷對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用機(jī)理，本研究將利用高通量基因芯片技術(shù)，挖掘杠柳毒苷體外抑制胃癌細(xì)胞增殖能力的分子調(diào)控模式，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)基于杠柳毒苷的抗腫瘤藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)來(lái)源

收集美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)維護(hù)的GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中所有經(jīng)杠柳毒苷處理的胃癌基因芯片數(shù)據(jù)，收集數(shù)據(jù)時(shí)間截至2016年5月3日。

1.2 數(shù)據(jù)庫(kù)資源

使用基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology，GO)對(duì)所分析得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋；使用京都基因與基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行代謝通路富集分析；使用轉(zhuǎn)錄作用元件數(shù)據(jù)庫(kù)(Transcriptional Regulatory Element Database，TRED)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子篩選。

1.3 方法

1.3.1 差異表達(dá)基因篩選及注釋 為探究杠柳毒苷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力影響的分子機(jī)制，使用R語(yǔ)言下載了GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中GSE78211數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)。使用MAS 5.0算法對(duì)數(shù)據(jù)集中的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理。使用Limma程序包中所提供的統(tǒng)計(jì)分析函數(shù)，計(jì)算了與胃癌SGC-7901細(xì)胞系相比，經(jīng)杠柳毒苷處理后SGC-7901胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平發(fā)生變化的基因。選取差異表達(dá)倍數(shù)≥5.0(Fold Charge≥5.0)為篩選閾值，篩選獲得差異表達(dá)基因。利用R語(yǔ)言，將篩選得到的差異表達(dá)基因與GEO數(shù)據(jù)庫(kù)提供的GPL平臺(tái)注釋信息進(jìn)行匹配，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行信息注釋。

1.3.2 差異表達(dá)基因GO功能注釋分析 為探究差異表達(dá)基因所參與的生物功能，對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋分析。提取差異表達(dá)基因GPL平臺(tái)注釋信息中的“Entrez_Gene_ID”信息，使用R語(yǔ)言GO程序包與GO數(shù)據(jù)庫(kù)信息，對(duì)每一個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，探究SGC-7901細(xì)胞中每一個(gè)經(jīng)杠柳毒苷作用而發(fā)生表達(dá)水平改變的基因功能，初步推測(cè)杠柳毒苷抗腫瘤作用的分子機(jī)制。

1.3.3 差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集分析 為進(jìn)一步探究差異表達(dá)基因參與生物代謝的代謝通路，對(duì)篩選得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG代謝通路富集分析。提取差異表達(dá)基因GPL平臺(tái)注釋信息中的“Entrez_Gene_ID”信息，應(yīng)用R語(yǔ)言KEGG程序包與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)信息，對(duì)每一個(gè)差異表達(dá)基因向已知的代謝通路進(jìn)行富集映射，探究差異表達(dá)基因集中映射的細(xì)胞代謝通路，初步推測(cè)杠柳毒苷所影響的主要代謝通路。

1.3.4 分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為進(jìn)一步挖掘杠柳毒苷體外抑制胃癌細(xì)胞增殖能力的分子調(diào)控模式，探究差異表達(dá)基因之間的相互調(diào)控作用關(guān)系，提取TRED數(shù)據(jù)庫(kù)中所收錄的所有人類轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)。通過(guò)Pearson相關(guān)性分析，提取基因間分子共調(diào)控作用關(guān)系。使用Cytoscape version 3.3.0軟件對(duì)得到的分子共調(diào)控作用關(guān)系進(jìn)行可視化展示，構(gòu)建出最終的分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

本研究共篩選得到差異表達(dá)基因1105個(gè)，其中552個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，553個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，表1、2分別展示差異表達(dá)最顯著的20個(gè)基因。

表1 Top 20上調(diào)表達(dá)基因信息

表2 Top 20 下調(diào)表達(dá)基因信息

對(duì)552個(gè)上調(diào)表達(dá)基因與553個(gè)下調(diào)表達(dá)基因分別進(jìn)行GO功能注釋分析。注釋分析結(jié)果顯示，上調(diào)表達(dá)基因主要參與葡萄糖代謝、鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)、鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)等生物過(guò)程(圖1.A)，參與構(gòu)成鈉離子通道復(fù)合體、復(fù)制叉、膜筏、生物質(zhì)膜等細(xì)胞組件(圖1.C)，以及參與鈉離子協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)載體活性、鉀離子泵活性、DNA結(jié)合等分子功能(圖1.E)；下調(diào)表達(dá)基因主要參與同嗜性細(xì)胞粘著、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過(guò)程(圖1.B)，參與聯(lián)會(huì)絲復(fù)合體、分泌顆粒體、細(xì)胞鏈接等細(xì)胞組件(圖1.D)，參與葡萄糖轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體活性、小GTP酶調(diào)節(jié)因子活性等等分子功能(圖1.F)。而對(duì)差異表達(dá)基因的KEGG代謝通路富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要參與腫瘤相關(guān)的諸多代謝通路(圖2)。

基于分子間共調(diào)控關(guān)系，最終構(gòu)建了杠柳毒苷作用后SGC-7901胃癌細(xì)胞中發(fā)生表達(dá)改變的分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(圖 3)。結(jié)果顯示，杠柳毒苷可能通過(guò)抑制MYC轉(zhuǎn)錄因子等經(jīng)典腫瘤增殖促進(jìn)因子的表達(dá)，間接調(diào)控下游眾多基因的表達(dá)，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。

圖1 差異表達(dá)基因GO功能注釋分析 A上調(diào)表達(dá)基因GO功能注釋生物過(guò)程(BP)條目；B下調(diào)表達(dá)基因GO功能注釋生物過(guò)程(BP)條目；C上調(diào)表達(dá)基因GO功能注釋細(xì)胞組分 (CC)條目；D下調(diào)表達(dá)基因GO功能注釋功能注釋細(xì)胞組分 (CC)條目；E上調(diào)表達(dá)基因GO功能注釋分子功能 (MF)條目；F下調(diào)表達(dá)基因GO功能注釋功能注釋分子功能(MF)條目。

圖2 差異表達(dá)基因KEGG代謝通路富集分析 A上調(diào)表達(dá)基因KEGG富集分析結(jié)果；B下調(diào)表達(dá)基因KEGG富集分析結(jié)果。

圖3 杠柳毒苷抑制胃癌SGC-7901增殖的分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 其中紅色圓代表上調(diào)表達(dá)基因；藍(lán)色圓代表下調(diào)表達(dá)基因；黃色菱形代表轉(zhuǎn)錄因子。

3 討論

目前已有研究顯示，來(lái)源于香加皮的提取物杠柳毒苷在體外對(duì)多種實(shí)體瘤細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性，能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。研究證實(shí)，杠柳毒苷能夠誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞系細(xì)胞、胃癌細(xì)胞系BGC-823細(xì)胞和乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系細(xì)胞的凋亡進(jìn)程[7-9]。與此同時(shí)，杠柳毒苷能夠通過(guò)阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，顯著地抑制包括肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等實(shí)體瘤細(xì)胞系的增殖，而杠柳毒苷的作用效果與其使用量呈正相關(guān)[10，11]。

腫瘤是一種復(fù)雜的系統(tǒng)性疾病，其發(fā)生發(fā)展是一系列具有相互作用關(guān)系關(guān)鍵基因的表達(dá)異常所導(dǎo)致的[12，13]，所以藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用同樣是通過(guò)復(fù)雜的作用方式達(dá)到抗腫瘤的效果。然而，傳統(tǒng)針對(duì)于單一分子表達(dá)異常的“還原論”研究模式，無(wú)法從整體系統(tǒng)層面上探究分子間的作用關(guān)系，無(wú)法具體地勾勒藥物作用的復(fù)雜分子機(jī)制。同時(shí)鑒于杠柳毒苷如何作用于腫瘤細(xì)胞，最終導(dǎo)致抗腫瘤效果的分子作用機(jī)制尚不明確，本研究利用高通量基因芯片技術(shù)，通過(guò)生物信息學(xué)手段，系統(tǒng)性地預(yù)測(cè)并構(gòu)建了一張杠柳毒苷作用于胃癌細(xì)胞系SGC-7901的分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該分子共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)從整體角度分析了經(jīng)杠柳毒苷處理后SGC-7901細(xì)胞系表達(dá)發(fā)生改變基因間相互作用關(guān)系，展示了杠柳毒苷通過(guò)調(diào)節(jié)包括MYC、MYB、SP2在內(nèi)的關(guān)鍵腫瘤增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，間接調(diào)控眾多下游基因表達(dá)水平的整體基因共調(diào)控模式，揭示杠柳毒苷潛在的抗腫瘤作用分子機(jī)制。為以杠柳毒苷為基礎(chǔ)的抗腫瘤藥物研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，同時(shí)為抗腫瘤藥物作用機(jī)理領(lǐng)域的研究提供了新的研究思路。

[1]中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000：211.

[2]Lu Z,Song Q,Yang J,et al.Comparative proteomic analysis of anti-cancer mechanism by periplocin treatment in lung cancer cells[J].Cell Physiol Biochem,2014,33(3):859.

[3]Cheng CF,Lu IH,Tseng HW,et al.Antitumor Effect of Periplocin in TRAIL-Resistant Human Hepatocellular Carcinoma Cells through Downregulation of IAPs[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:958025.

[4]Lu ZJ,Zhou Y,Song Q,et al.Periplocin inhibits growth of lung cancer in vitro and in vivo by blocking AKT/ERK signaling pathways[J].Cell Physiol Biochem,2010;26(4-5):609.

[5]Zhao L,Shan B,Du Y,et al.Periplocin from Cortex periplocae inhibits cell growth and down-regulates survivin and c-myc expression in colon cancer in vitro and in vivo via beta catenin/TCFsignaling[J].Oncol Rep,2010,24(2):375.

[6]單保恩，趙連梅，何蘭欣,等.杠柳苷對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖的一直作用及與Rb蛋白表達(dá)的關(guān)系[J].癌變·畸變·突變，2008，10(5)：342.

[7]張 靜，張 超，楊 光,等.香加皮杠柳苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞凋亡及Survivin表達(dá)的影響[J].醫(yī)藥報(bào)道，2015.06，34(6)：705.

[8]單保恩，李俊新，張 靜.香加皮水提取物誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡及其作用機(jī)制[J].中草藥，2005，36(8)：1184.

[9]張建彬，單保恩，王 玲,等.中藥香加皮杠柳苷抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖和侵襲及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[C].河北省免疫學(xué)會(huì)第六次免疫學(xué)大會(huì)資料匯編，2010-08-14.

[10]劉麗娟，李 健，畢志明.中藥香加皮的抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，28(3)：317.

[11]張 靜，楊 光，單保恩,等.香加皮杠柳苷對(duì)MCF-7細(xì)胞周p21WAF1/CIP1表達(dá)的影響[J].腫瘤防治研究，2010，37(8)：864.

[12]Young-In Kim.Role of Folate in Colon Cancer Development and Progression[J].J Nutr,2003,133(11):3731.

[13]Chan JM,Gam PH,Giovannucci EL.Role of diet in prostate cancer development and progression[J].Journal of Clinical Oncology,2005,23(32):8152.

Construction of Gene-Coregulation-Network for Inhibition Activities of Periplocin on gastric cancerexvivo

WANGJu-wei,ZANGWen-yuan,DIAOKai,etal.

(TheGeneralHospitalofJinlinOilField,Songyuan138000,China)

Objective In this study,we constructed a Gene-Coregulation-Network to demonstrate the molecular mechanism of how periplocin inhibits the proliferation of gastric cell line SGC-7901.This study may lay a foundation for underlining the molecular mechanism of the anti-tumor activity of periplocin.Methods By collecting SGC-7901 gene expression profiling data from GEO database,we analyzed the differentially expressed genes.Utilizing GO and KEGG database,we annotated all of the differentially expressed genes.Finally,using transcription factor data provided by TRED database andpearsoncorrelation analysis,we constructed a gene coregulation network.Results Compared with normal SGC-7901 cell lines,1105 genes were differentially expressed in the SGC-7901 cells treated with periplocin,among which 552 genes were up regulated and 553 genes were down regulated.GO annotation results showed that up regulated genes mainly took part in biological functions including glucose metabolism,potassium ion transport and sodium ion transport,and down regulated genes mainly took park in biological functions including hemophilic cell adhesion,amino acid transport,small GTPase mediated signal transduction.KEGG pathway enrichment analysis results showed that,the differentially expressed genes mainly join many cancer-related metabolism pathways.Finally,based on the transcription factor data andpearsoncorrelation analysis,we constructed a gene co-regulation network.Conclusion Based on molecular co-regulation analysis,we systemically mining the molecular mechanism of periplocin.

Periplocin;Gastric cancer SGC-7901 cell line;Gene-coregulation-network;Cell proliferation

1007-4287(2017)03-0392-04

R735.2

A

王炬瑋(1980-)，女，吉林省松原市，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤的診斷與治療。

2016-09-11)