利用SSR標(biāo)記對(duì)秈稻品種（系）聚類分析的比較研究

林 強(qiáng)，李生強(qiáng)，張瑞越，周國(guó)華，鄒 杰，黎世齡，羅筱平

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000）

利用SSR標(biāo)記對(duì)秈稻品種（系）聚類分析的比較研究

林 強(qiáng)，李生強(qiáng)，張瑞越，周國(guó)華，鄒 杰，黎世齡，羅筱平

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000）

以24個(gè)秈稻品種（系）為材料，利用SSR標(biāo)記技術(shù)分別采用NTSYS軟件、DPS軟件和MAGE軟件在4種情況下進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，無(wú)論是利用NTSYS軟件通過(guò)相關(guān)系數(shù)，還是利用DPS軟件和MAGE軟件通過(guò)遺傳距離進(jìn)行聚類分析，都基本能將恢復(fù)系、三系不育系、短光敏不育系3個(gè)類群分開(kāi)，但由于所選標(biāo)記及其檢測(cè)到的等位基因數(shù)量不同，聚類的結(jié)果也隨之不同，特別是水稻恢復(fù)系和不育系兩大類群下的各亞類的分類結(jié)果不同。因此，認(rèn)為只有首先確定合理的引物數(shù)量及其檢測(cè)到的等位基因數(shù)，才能較為準(zhǔn)確地進(jìn)行聚類分析，進(jìn)而有效地劃分雜種優(yōu)勢(shì)群。

秈稻；SSR標(biāo)記；聚類分析；雜種優(yōu)勢(shì)群

水稻是世界上最主要的糧食作物之一，全球有50%以上的人以水稻為主食［1］。預(yù)計(jì)到2050年，全球水稻產(chǎn)量增長(zhǎng)1倍才能滿足不斷增長(zhǎng)的人口需求［2］。因此，水稻高產(chǎn)育種一直以來(lái)都是育種工作者的重要目標(biāo)之一。20世紀(jì)70年代水稻雄性不育遺傳資源的發(fā)現(xiàn)和雜種優(yōu)勢(shì)的利用，推動(dòng)了水稻雜交育種的發(fā)展，使水稻產(chǎn)量有了突飛猛進(jìn)的增長(zhǎng)。然而，近幾十年，中國(guó)水稻產(chǎn)量一直沒(méi)有突破性進(jìn)展。眾所周知，雜交親本的合理選配是雜種優(yōu)勢(shì)有效利用的關(guān)鍵，而適度的遺傳差異與雜種優(yōu)勢(shì)密切相關(guān)。因此，將雜交親本準(zhǔn)確的劃分為不同的類群，分析其遺傳多樣性，可以有效提高雜交水稻強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合選育效率。陸作楣等［3］建議以省為單位，將已經(jīng)推廣的雜交稻親本綜合利用分子標(biāo)記聚類、配合力分析和表型聚類等多種方法，構(gòu)建水稻雜種優(yōu)勢(shì)群，并明確主要的雜交模式。

通過(guò)DNA分子標(biāo)記研究品種間遺傳多樣性及聚類分析是目前應(yīng)用廣泛的手段之一。研究表明，SSR標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、不受環(huán)境和生育期的影響等優(yōu)點(diǎn)，而且標(biāo)記多態(tài)信息量高，位點(diǎn)已定位在圖譜上，適合種質(zhì)的遺傳多樣性及聚類分析［4-7］。隨著我國(guó)玉米遺傳多樣性及雜種優(yōu)勢(shì)群理論的深入研究［8-9］，水稻雜交親本的聚類分析及雜種優(yōu)勢(shì)群理論的研究也逐漸受到人們重視。張濤等［10］利用SSR標(biāo)記研究了三系雜交水稻親本的遺傳多樣性；羅小金等［11］用36對(duì)SSR引物對(duì)秈稻材料進(jìn)行檢測(cè)，得到281個(gè)等位基因，將58份水稻材料劃分為3個(gè)類群；姚棟萍等［12］利用19對(duì)SSR引物對(duì)90份常用水稻品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建指紋圖譜。李愛(ài)宏等［13］利用48對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)20個(gè)秈稻品種進(jìn)行聚類，并分析了雜種優(yōu)勢(shì)模式。王勝軍等［14］利用72對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)47個(gè)雜交秈稻親本進(jìn)行聚類分析，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)踐提出7種雜種優(yōu)勢(shì)組合配組模式。

利用分子標(biāo)記進(jìn)行聚類分析時(shí)，不同研究者選取的標(biāo)記及檢測(cè)到的等位基因數(shù)量都不相同，但都未說(shuō)明所選用標(biāo)記數(shù)量的合理性。本研究用94對(duì)擴(kuò)增條帶穩(wěn)定的多態(tài)性引物，在24個(gè)水稻雜交親本中檢測(cè)到272個(gè)等位基因，根據(jù)PIC值選擇不同引物數(shù)及相應(yīng)的等位基因，采用不同的軟件進(jìn)行聚類分析，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析，旨在為雜交水稻親本精確的聚類分析、遺傳多樣性分析以及雜種優(yōu)勢(shì)的高效利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用本課題組選配雜交組合的24個(gè)秈型水稻品種（系）。包括18個(gè)恢復(fù)系（93-11、 R148、R140、R0285、R3436、R3253、R1536、R441、R310、D254、R1037、R66、R121、明恢63、R539、R362、R6258和R1113），6個(gè)不育系（優(yōu)IA、五豐A、三A、益豐A、珍汕97A和D38S），其中D38S是宜春學(xué)院選育的短光敏核不育系［15-16］。

1.2 SSR分析方法

1.2.1 DNA提取 采取CTAB方法提取水稻基因組DNA［17］。

1.2.2 SSR引物選擇 本試驗(yàn)室合成水稻SSR引物近1 000對(duì)，根據(jù)網(wǎng)上公布數(shù)據(jù)（http：// www.gramene.org），按照引物在93-11染色體上的位點(diǎn)，所選引物均勻的分布在水稻各染色體上，共選擇157對(duì)SSR引物。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物分離 PCR反應(yīng)采用20μL體系：模板DNA 2.0μL（25 ng/μL），Taq酶 0.1μL（5.0U/μL），引物2.0μL，dNTP 2.0μL（10 mmol/L），2.0μL 10×Buffer（不含Mg+）MgCl21.0μL（25 mmol/L），用ddH2O補(bǔ)足到20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性40 s，55～60℃退火（根據(jù)引物選擇）30s，72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠分離。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

SSR擴(kuò)增產(chǎn)物以0、1統(tǒng)計(jì)建立數(shù)據(jù)矩陣。相同的遷移位置，有帶者記為1，無(wú)帶者記為0。SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（PIC）按以下公式計(jì)算：

式中，Pij為 i標(biāo)記第 j個(gè)等位基因的頻率（Botstein 1980）。根據(jù)PIC值選擇不同數(shù)量引物及相應(yīng)檢測(cè)到的等位基因數(shù)量，分別利用常用聚類軟件NTSYS［18］、唐啟義等開(kāi)發(fā)的DPS軟件［19］及MEGA軟件［20］進(jìn)行聚類分析，遺傳距離計(jì)算采用Jicard方法，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用157對(duì)SSR引物，對(duì)24個(gè)雜交秈稻親本品種（品系）進(jìn)行擴(kuò)增分析。從中篩選出94對(duì)帶型清晰穩(wěn)定的引物分布于水稻12條染色體上。這94對(duì)引物共檢測(cè)出272個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到的等位基因?yàn)?.89個(gè)，變化范圍1～7個(gè)。每條染色體上檢測(cè)出的等位基因范圍是8～44個(gè)，平均每條染色體檢測(cè)到等位基因?yàn)?2.67。所檢測(cè)到的每個(gè)SSR引物位點(diǎn)的多態(tài)信息量（PIC）變化范圍在0.08～0.89，平均為0.68（表1，圖1）。

表1 SSR引物的多態(tài)信息

圖1 引物RM13630和RM24330在24個(gè)秈稻品種（系）擴(kuò)增情況

2.2 聚類分析比較

2.2.1 利用NTSYS聚類分析 根據(jù)PIC值不同，分別選取不同引物及其檢測(cè)到的等位基因：（1）94對(duì)引物檢測(cè)到272個(gè)等位基因；（2）PIC大于0.6時(shí)，72對(duì)引物檢測(cè)到234個(gè)等位基因；（3）PIC大于0.7時(shí)，54對(duì)引物檢測(cè)到200個(gè)等位基因；（4）PIC值大于0.75時(shí)，37對(duì)引物檢測(cè)到151個(gè)等位基因。在這4種情況下利用NTSYS軟件分別進(jìn)行聚類分析，都能將24個(gè)水稻品種（系）分為三大類：恢復(fù)系類、三系不育系及短光敏不育系D38S。相關(guān)系數(shù)分別為0.8229、0.8486、0.8019和0.7645。當(dāng)引物數(shù)量少于54對(duì)，檢測(cè)到等位基因少于200的情況下，聚類結(jié)果將恢復(fù)系R66聚類到三系不育系類群中，并在三系不育系類群下單獨(dú)聚為一亞類，而三系不育系材料三A聚到恢復(fù)系類群中；當(dāng)引物數(shù)量達(dá)到72對(duì)以上，檢測(cè)到的等位基因數(shù)量達(dá)到234以上時(shí)，可較為準(zhǔn)確地將恢復(fù)系和不育系分開(kāi)，只不過(guò)隨著當(dāng)檢測(cè)到的等位基因數(shù)量的增加，相關(guān)系數(shù)又有減小趨勢(shì)。同時(shí)，在恢復(fù)系類群下，不同情況下各亞群聚類結(jié)果有所不同（圖2）。

圖2 NTSYS軟件聚類分析

2.2.2 利用DPS聚類分析 采用相同方法利用DPS軟件，在4種情況下分別對(duì)24個(gè)水稻品種（系）進(jìn)行聚類分析。圖3表明，利用37對(duì)引物進(jìn)行聚類時(shí)，結(jié)果與NTSYS軟件分析類似；而利用54對(duì)和72對(duì)引物進(jìn)行聚類分析時(shí)，除了恢復(fù)系、三系不育系、短光敏不育系三大類群外，明顯將恢復(fù)系R66單獨(dú)聚為第4個(gè)類群；利用94對(duì)引物分析時(shí)，將24個(gè)水稻品種（系）聚為恢復(fù)系、三系不育系和短光敏不育系D38S 3類，這與利用NTSYS軟件，在引物數(shù)量達(dá)到72對(duì)以上時(shí)的結(jié)果相似。

圖3 DPS軟件聚類分析

2.2.3 利用MEGA聚類分析 根據(jù)李亞玲等［17］的分析方法，分別在4種情況下，先使用DPS軟件進(jìn)行0、1數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類方法獲得遺傳距離矩陣，然后利用MEGA5.2，采用UPGMA進(jìn)行聚類分析。當(dāng)利用37對(duì)引物進(jìn)行聚類分析時(shí)，將24個(gè)秈稻品種（系）聚為恢復(fù)系、三系不育系和短光敏不育系，和前兩種軟件分析結(jié)果相同的是將三A聚在恢復(fù)系類群中，不同的是沒(méi)有將R66聚到三系不育系類群中。當(dāng)引物數(shù)量超過(guò)54對(duì)時(shí)，聚類分析的結(jié)果與引物數(shù)量達(dá)到72對(duì)以上，進(jìn)行NTSYS軟件分析時(shí)的結(jié)果相似，同時(shí)也與引物數(shù)量達(dá)到94對(duì)時(shí)，進(jìn)行DPS軟件聚類分析結(jié)果相似（圖4）。

3 結(jié)論與討論

利用SSR標(biāo)記對(duì)水稻品種進(jìn)行遺傳多樣性及聚類分析時(shí)，不同的研究者選用的標(biāo)記數(shù)及其檢測(cè)到的等位基因大相徑庭。本研究中，利用NTSYS軟件通過(guò)相似系數(shù)進(jìn)行聚類分析時(shí)，所用標(biāo)記及其檢測(cè)出的等位基因較少時(shí)，將個(gè)別不育系聚到恢復(fù)系群中，恢復(fù)系卻聚到不育系群中，隨著標(biāo)記和所檢測(cè)到的等位基因的增加，相關(guān)系數(shù)也會(huì)隨之達(dá)到相對(duì)最大值，同時(shí)將24個(gè)水稻品種（系）劃分為恢復(fù)系、三系不育系和短光敏不育系3類，而當(dāng)?shù)任换蜻_(dá)到272時(shí)，相關(guān)系數(shù)有減小趨勢(shì)。而利用DPS和MEGA軟件通過(guò)遺傳距離進(jìn)行聚類分析，隨著標(biāo)記數(shù)量和等位基因的增加，恢復(fù)系和三系不育系類群的劃分越準(zhǔn)確。3種軟件都能將24個(gè)秈稻品種（系）準(zhǔn)確的聚為恢復(fù)系、三系不育系和短光敏不育系三大類群，只不過(guò)所需要引物數(shù)量及檢測(cè)到等位基因數(shù)不同，NTSYS分析需要72對(duì)以上的引物，檢測(cè)到的等位基因數(shù)達(dá)到234個(gè)以上，DPS軟件分析需要94對(duì)引物檢測(cè)到272個(gè)等位基因數(shù)，而MEGA軟件分析僅需要54對(duì)以上的引物，檢測(cè)到的等位基因數(shù)超過(guò)200個(gè)時(shí)即可。利用分子標(biāo)記對(duì)水稻進(jìn)行聚類分析是進(jìn)行水稻遺傳多樣性研究的有效手段之一，要提高聚類結(jié)果的準(zhǔn)確性，首先必須根據(jù)選用聚類方法分析確定最合理的標(biāo)記及其檢測(cè)到的等位基因數(shù)量。此外，分子標(biāo)記在水稻各染色體上的分布情況也會(huì)影響到分析結(jié)果。

圖4 MEGA軟件聚類分析

短光敏不育系D38S具有長(zhǎng)光可育、短光不育的特性，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)日照條件下繁殖、短日照條件下制種，特別是在低緯度地區(qū)具有應(yīng)用前景，是一種新型的兩用不育系［16］。在本研究中，不論采用哪種軟件，在4種情況下都能將其單獨(dú)聚為一類，說(shuō)明D38S與其他三系不育系材料間有較大遺傳差異。今后將結(jié)合生產(chǎn)上常用兩系不育系材料進(jìn)行對(duì)比研究，深入探討其在生產(chǎn)上潛在的利用價(jià)值。

此外，從3種軟件易用性方面看，DPS軟件具有中文操作界面，且統(tǒng)計(jì)與結(jié)果分析兼?zhèn)洌贓xcel中錄入的數(shù)據(jù)可以直接粘貼至DPS軟件進(jìn)行分析，操作比較簡(jiǎn)單，但DPS軟件不能對(duì)生成的聚類圖形進(jìn)行優(yōu)化編輯。利用DPS軟件獲得遺傳距離矩陣，然后利用MEGA軟件進(jìn)行聚類分析，可以優(yōu)化編輯聚類圖［21］，但缺點(diǎn)在于MEGA做聚類分析時(shí)，不能識(shí)別含有漢字字符的品種（系）名稱。而NTSYS軟件無(wú)法直接粘貼數(shù)據(jù)，需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的操作將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成其可以識(shí)別的文件格式，然后才能進(jìn)行聚類分析。

隨著雜交水稻的發(fā)展，育種家們不斷的培育恢復(fù)系與不育系，從中選育具有強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)的組合，一方面雜交親本間遺傳差異逐漸縮小，另一方面工作量不斷增大，而選育效率卻逐步下降。從玉米雜種優(yōu)勢(shì)的成功利用可以清楚地看到，不斷提高玉米自交系的一般配合力和組合的特殊配合力是雜交玉米育種工作的主線，而玉米自交系聚類分析及雜種優(yōu)勢(shì)群的研究在其中發(fā)揮了重要作用［22］。水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用了幾十年，但對(duì)雜交親本的聚類分析及雜種優(yōu)勢(shì)群研究相對(duì)比較滯后。僅認(rèn)識(shí)到水稻不育系和恢復(fù)系是兩大優(yōu)勢(shì)群是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，篩選出特殊配合力較高的優(yōu)勢(shì)群，是強(qiáng)優(yōu)勢(shì)組合高效選育的基礎(chǔ)。本研究為水稻雜交親本精確的聚類分析及雜種優(yōu)勢(shì)群研究提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 楊賢智）

Comparative study on cluster analysis of 24 indica rice varieties（lines）by SSR markers

LIN Qiang，LI Sheng-qiang，ZHANG Rui-yue，ZHOU GUO-hua，ZOU Jie，LI Shi-ling，LUO Xiao-ping
（College of Life Science and Environmental Resources，Yichun University，Yichun 336000，China）

Cluster analysis of 24 indica rice varieties（lines）by 4 different SSR primers using NTSYS，DPS and MAGE software were implemented in this study. The results showed that three groups including restorer lines，cytoplasmic male sterile lines and short photoperiod sensitive sterile lines were distinguished no matter using NTSYS software by the similarity factor，or using DPS and MAGE software clustering analysis based on genetic distance，the results of clustering analysis were different with the number of markers and alleles，especially the sub group under the male sterile lines and restorer lines，which were recognized as dominant group of rice. This study suggests that the number of alleles detected by molecular markers affects the accuracy of clustering results and the effective construction of rice heterosis groups.

indica；SSR markers；cluster analysis；heterotic groups

S511.01

A

1004-874X（2017）01-0001-07

2016-09-25

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（151034）

林強(qiáng)（1993-），男，學(xué)士，E-mail：linqdeyx@163.com

李生強(qiáng)（1978-），男，博士，講師，E-mail：lisqyuer@163.com

林強(qiáng)，李生強(qiáng)，張瑞越，等. 利用SSR標(biāo)記對(duì)秈稻品種（系）聚類分析的比較研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（1）：1-7.