OsMT-1-4c基因原核表達載體的構建、表達及重金屬抗性研究

唐 偉，張 美，王小蘭

（1.廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006；2.中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650）

OsMT-1-4c基因原核表達載體的構建、表達及重金屬抗性研究

唐 偉1，張 美2，王小蘭1

（1.廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006；2.中國科學院華南植物園，廣東 廣州 510650）

為研究水稻抗重金屬的特性，構建了水稻金屬硫蛋白（metallothionein，MT）原核表達載體PGEX4T-3-OsMT-1-4c，并轉化到Rossetta菌株中誘導表達，得到大小為33.643 kDa的GST-OsMT-1-4c重組蛋白。將得到的沉淀用1×PBS溶解并在低溫下超聲破碎，離心并電泳檢測，然后純化得到融合蛋白。并在重金屬Cd2+脅迫下誘導表達重組載體和空載體菌株，發現能表達GST-OsMT-1-4c蛋白菌株比表達GST蛋白菌株抗重金屬的能力強。

水稻；金屬硫蛋白；原核表達；純化；抗重金屬特性

重金屬在環境中是普遍存在的，對植物而言，重金屬分為必需元素和非必需元素，但是非必需重金屬元素和過量的必需重金屬元素對植物的生長和發育都是有害的，對植物毒害作用主要表現在損傷細胞膜［1］、破壞線粒體和葉綠體的超微結構［2］、減少葉綠素和抗壞血酸含量、產生活性氧分子、降低各種的酶活性［3］，繼而阻礙植物呼吸代謝、光合作用［4］和細胞分裂等生命活動的正常進行。植物生長在重金屬污染的環境中［5］，受重金屬的脅迫，植物與重金屬接觸的界面首先受到影響，并且這種影響隨著脅迫時間的延長，隨重金屬濃度的升高，植物的受害亦加劇。植物受重金屬的傷害程度、傷害癥狀與重金屬的種類也有密切關系。重金屬能夠通過農作物直接參與食物鏈循環［6］，最終在人體內富集［7］，使人體健康受到危害。水稻是我國種植面積最大的糧食作物，稻米的產量、品質及其安全問題一直是社會關注的焦點。當重金屬進入水稻體內后，大部分會積累在水稻根部［8］，很少一部分向地上組織遷移，積累在主莖稻穗、葉片以及籽實中［9］。水稻籽實不同部位中的重金屬含量較不均勻，胚乳中總量最高［10］。據報道，我國華南地區稻米重金屬含量符合標準的只有64.8%［11］。因此，研究水稻體內響應金屬脅迫的關鍵基因，揭示其對重金屬離子的吸收、轉運和解毒方面的分子機制［12］，對水稻的逆境育種、提高稻米的品質和解決食品安全問題有重大意義。

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）的研究是當今生物化學和分子生物學的熱點之一，研究表明金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸，能結合重金屬的低分子量的蛋白。其主要功能是與重金屬離子結合，一般通過半胱氨酸殘基與金屬離子結合成螯合物從而減輕或消減重金屬的毒害作用［13］。此外MT 具有清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）的功能在抗衰老、抗氧化壓力及細胞凋亡等過程中發揮著重要作用，且MT是一種潛在的細胞凋亡負調控因子，在化療中對正常機體細胞有一定的保護作用［14］，但其作用機理仍不清楚。由于植物體內MT的含量很低、分子量極小、富含的半胱氨酸殘基極易被氧化，導致對植物MT的研究主要停留在轉錄水平上，而對其功能的研究相對較少。有研究報道MT具有耐受重金屬Cd的特性［15］，MT的大量表達能顯著提高植物耐受性。當今對水稻金屬硫蛋白基因家族的研究較多，但是對OsMT-1-4c基因研究相對較少，現有的文獻還沒有純化得到其蛋白，也沒有對其重金屬特性做初步研究，因此本實驗室從水稻cDNA酵母表達文庫［16］中分離得到了OsMT-1-4c基因（http：//rice.plantbiology.msu.edu/， LOC_ Os01g10400），并將其構建到PYES260載體上保存，其基因大小為237 bp，編碼78個氨基酸，其半胱氨酸含量達到16.7 %，從而推測其具有較強的抗重金屬能力。本研究構建了水稻金屬硫蛋白重組表達質粒PGEX4T-3-OsMT-1-4c，轉入Rossetta菌株中誘導表達重組蛋白，優化誘導條件后，產生大量可溶的谷胱甘肽巰基轉移酶融合蛋白（GST-OsMT-1-4c），并純化得到了該重組蛋白。通過在重金屬脅迫下產生重組蛋白的菌株與GST的菌株其生長曲線相比較，發現產生重組蛋白的菌株比GST蛋白菌株生長狀況好很多，表明OsMT-1-4c蛋白在Rossetta菌株中的表達提高了其抗重金屬的能力，從而初步驗證了OsMT-1-4c蛋白具有抗重金屬能力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

原核表達載體PGEX4T-3、重組質粒PYES260和大腸桿菌DH5α由本實驗室保存；限制性內切酶BamHⅠ、XhoI購自TaKaRa公司； IPTG購自艾基生物技術有限公司、膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Magen公司、GST Bind Resin和填料柱購自Novagen公司、引物合成及序列測定由上海英駿生物技術有限公司提供。

LB培養基配方：胰蛋白胨（Tryptone）10 g/L，酵母提取物（Yeast extract）5 g/L，氯化鈉（NaCl）10 g/L，用2.5 mol/LNaOH調節培養基的pH，使其達到7.4，去離子水定容至1 L，即配成液體LB培養基。固體培養基100 mL添加1.5 g瓊脂粉，然后120℃、20 min滅菌，待LB培養基不燙手后加入氨芐青霉素，至終濃度100 μg/mL，倒平板，凝固后放入4℃ 冰箱保存備用。

2×YT培養基配方：胰蛋白胨（Tryptone）10 g/L，酵母提取物（Yeast extract）5 g/L，氯化鈉（NaCl）10 g/L，用2.5 mol/L NaOH調節培養基的pH，使其達到7.2，去離子水定容至1 L，即配成液體2×YT培養基。固體培養基100 mL添加1.5 g瓊脂粉，然后120℃ 、20 min滅菌，冷卻后室溫保存備用。

SDS-PAGE所用試劑：30%丙烯酰胺混合液（Acr∶Bis為29∶1）：將60 mL水預熱至37 ℃，加入丙烯酰胺（Ars）29 g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0 g，溶劑定容至100 mL，并用0.45微米孔徑濾紙過濾，裝入棕色瓶中4℃ 保存；1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液：取1 mol/L HCl溶液48 mL、三羥基甲烷（Tris）36.6 g，加雙蒸至90 mL，調pH至8.8，然后定容至100 mL，至于玻璃瓶中保存，室溫貯存； 5×電泳緩沖液：取15.1 g Tris 和94 g甘氨酸溶于800 mL去離子水中，再加入5 g SDS，調節pH至8.3，定容至1 L；10%過硫酸銨（AP）：過硫酸銨0.2 g于2.0 mL EP管中，定容至2 mL，現用現配；10%SDS（十二烷基磺酸鈉）：取10 g SDS加去離子水80 mL，68℃水浴加熱溶解定容至100 mL，室溫保存。

GST-OsMT-1-4c純化所需試劑：結合液：Na2HPO4·12H2O 2.9 g，KH2PO40.2 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，加 0.8 L 去離子水溶解，調pH 7.3，去離子水定容至 1 L，4℃保存；洗脫液：Tris 堿0.605 g，還原型谷胱甘肽（reduced glutathione）0.307 g，加 80 mL去離子水溶解，調 pH 8.0，去離子水定容 100 mL，-20℃保存。

1.2 重組質粒PGEX4T-3-OsMT-1-4c的構建

將含有OsMT-1-4c基因序列的質粒PYES260作為PCR的模板，通過網站 Convert Primers Into In-Fusion? Primers（http：//bioinfo. clontech.com/infusion/convertPcrPrimersInit.do）設計引物如下：

OsMT-1-4c-PEF：CTGGTTCCGCGTGGATCCAT GTCTTGCTGCGGAGGAAG

OsMT-1-4c-PER：ACGATGCGGCCGCTCGAGTT AGCAGTTGCAGGGATTGC

PCR反應體系（50μL）：10×Buffer 5.0μL，dNTP4.0μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，模板1μL，引物4μL，H2O 35.5μL。膠回收純化的目的片段連接到PGEX4T-3的載體（已由NcoI和BamHI雙酶切）上，轉入大腸桿菌DH5α，菌落PCR鑒定，并將鑒定正確的PGEX4T-3-OsMT-1-4c保存菌種。

1.3 GST-OsMT-1-4c誘導表達

將測序正確的PGEX4T-3-OsMT-1-4c質粒轉化到Rossetta感受態細胞，挑取單菌落進行PCR鑒定陽性克隆。陽性單克隆接種于2 mL含100μg/mL 氨芐青霉素 （Amp）、50μg/mL卡那霉素（Kam）、34μg/mL氯霉素（Chl）的 LB培養基上，37℃ 200 r/min過夜培養，按體積比1∶100轉接到100 mL LB（含AmpKanChl）新鮮2×YT培養基，相同條件下培養，當OD600值到0.4～0.6，加異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.2 mmol/L，誘導表達，收集菌液離心，并用SDSPAGE凝膠電泳分析誘導表達結果。

1.4 GST-OsMT-1-4c蛋白純化

通過SDS－PAGE電泳檢測融合蛋白已經大量表達，收集菌體，沉淀用1×PBS懸浮，超聲破粹30 min（9 s開，9 s關）離心50 min（4℃，8 000 r/min），收集上清液和沉淀，SDSPAGE檢測融合蛋白在上清液還是沉淀中，如果在上清液中，則利用有GST標簽的層析柱進行蛋白純化。

1.5 重金屬抗性分析

1.5.1 適合的金屬離子濃度確定 通過分光光度計測定重金屬脅迫下重組大腸桿菌的生長狀況，并將PGEX4T-3的空載體作為對照，比較表達OsMT蛋白的大腸桿菌Rossetta耐受重金屬離子鎘的能力［17］。前期實驗確定了Rossetta菌對Cd2+耐受范圍，因此對Cd2+通過0、0.8、1.0、1.2 mmol/L濃度梯度試驗，重復3次，確定金屬離子合適的濃度。誘導方法如前所述，將加入IPTG和重金屬離子定為0 h，每隔1 h測定1次OD600值，以OD600為縱軸、時間為橫軸作圖，確定對細菌生長和增殖有一定抑制作用，且未使細菌全部死亡的濃度范圍。

1.5.2 表達GST-OsMT-1-4c與GST蛋白的Rossetta菌對重金屬抗性比較 用吸光度法研究表達OsMT的大腸桿菌Rossetta細胞對金屬離子的耐受性，并將空載體PGEXT4T-3菌株作對照，重復3次。在Rossetta菌液中加入IPTG和合適的金屬離子濃度誘導，繼續培養并每隔1 h測定一次OD600值，以OD600為縱軸作圖。

2 結果與分析

2.1 PGEX4T-3-OsMT-1-4c載體的構建

根據引物所在位置，PCR的大小應為 237 bp，電泳檢測結果顯示在200～400 bp位置有條帶（圖1），說明OsMT-1-4c基因已經克隆成功，然后In-fusion連接并轉化DH5α菌株，37℃培養，挑取單菌落進行菌落PCR鑒定，結果顯示在200～400 bp位置有條帶（圖2）。再對該單菌落提取質粒測序，確定OsMT已經正確插入載體PGEX4T-3中，表明已經成功構建了PGEX4T-3-OsMT-1-4c的表達載體。

圖1 PCR擴增 OsMT cDNA電泳結果

圖2 PGEX4T-3-OsMT-1-4c菌液 PCR電泳結果

2.2 GST-0sM-1-4c蛋白誘導表達

將轉入鑒定正確的載體菌株誘導表達，設收集菌體，SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示在37℃、3 h和0.2 mmol/L IPTG時蛋白誘導表達最大（圖3）。將誘導表達最大的條件大量誘導，收集菌體，超聲破碎收集上清和沉淀，發現融合蛋白基本在上清液中，將上清液低溫保存備用。

圖3 GST-OsMT-1-4C和GST蛋白誘導表達

2.3 GST-0sM-1-4c蛋白純化

將大量表達蛋白的上清液進行GST親和層析柱純化，得到蛋白洗脫液，再取少量洗脫液進行SDS－PAGE電泳分析，在26～34 kDa位置只有一條很粗的條帶，GST大小為26 kDa，OsMT-1-4c蛋白大小為8 kDa，表明得到了純化的融合蛋白GST-0sM-1-4c（圖4）。

圖4 GST-OsMT-1-4c蛋白純化

2.4 重金屬抗性分析

2.4.1 適合的金屬離子濃度確定 選用Cd2+作為研究的金屬離子［18］，方法如前所述，每小時測定一次OD600值，重復3次，以時間為橫軸作圖（圖5），確定對Rossetta菌的生長和增殖有一定抑制作用，又未使細菌全部死亡的濃度范圍。通過比較4個濃度梯度細菌的生長狀況發現，1.0 mmol/L濃度梯度下細菌的生長曲線斜率接近1，即在此濃度下對Rossetta菌的生長和增殖有一定抑制作用，又不至于死亡。從而確定實驗合適濃度是1.0 mmol/L CdCl2。為了確定重組菌與對照菌（轉入空載體PGEX4T-3的Rossetta菌）之間，在沒有任何處理的情況下其生長狀況是否一致，按上述方法培養大腸桿菌，結果顯示當培養液不添加金屬離子時，對照菌與重組菌生長狀況基本相同，為進一步的實驗排除干擾。

圖5 Cd2+對含GST基因的Rossetta菌生長狀況的影響

2.4.2 表達GST-OsMT-1-4c 與GST蛋白的Rossetta菌對重金屬抗性比較 如圖6所示，1.0 mmol/L CdCl2處理3 h內，對照菌和重組菌增長沒有明顯差異；處理3 h后，表達OsMT蛋白的重組菌增長率明顯高于對照菌。說明表達OsMT融合蛋白確實增強了Rossetta菌對Cd離子的耐受性，提高了細菌的存活率，從而使相應的重組菌表現出耐受重金屬離子的能力。

圖6 Cd2+對表達GST和GST-MT-1-4c蛋白的Rossetta菌生長狀況的影響

3 結論與討論

金屬硫蛋白是一類富含半胱氨酸殘基的低分子量蛋白，能通過半胱氨酸殘基上的巰基基團與金屬離子結合，從而減輕重金屬離子對植物體的危害。目前，對植物MT蛋白的研究很多，如在蠶豆中對MT基因的表達分析認為［19］，MT能與金屬離子直接結合［20］，穩定植物內環境中金屬離子的含量，并能有效的轉運金屬離子到有需要的組織，從而說明了植物MT基因參與了金屬離子的運輸的功能。在擬南芥中利用轉MT-Ⅱ基因的超表達植株，分析表明，轉基因擬南芥能有效維持體內氧自由基的含量，減少MDA的產生，從而緩解干旱脅迫引起的傷害，提高抗旱性［21］等。金屬硫蛋白基因豐富的巰基含量及重金屬結合的能力決定了功能的多樣性。目前雖然對抗重金屬方面研究不斷深入，但是對其他功能尚不清楚，加上已知的植物MT蛋白較少，進一步阻礙了對MT功能的研究。因此，水稻金屬硫蛋白表達載體的構建及抗重金屬特性初步研究，將有助于進一步研究植物MT的功能。

由于金屬硫蛋白在植物體內含量較少，分子量極低，且半胱氨酸極易被氧化，因此很難檢測其在生物體內的表達活性。本研究的OsMT-1-4c蛋白僅為7.643 kDa左右，在大腸桿菌中表達很難直接檢測。因此，本研究選用含有GST標簽的蛋白表達載體PGEX4T-3，其GST大小為26 kDa，是根據唐青藍等［22］用PGEX4T-3成功構建了原核表達載體，并與王娟等［23］選擇PGEX系列構建海州香薷金屬硫蛋白重組表達質粒PGEX-2T-Eh MT1相類似，為大量表達和純化重組蛋白GST-OsMT-1-4c提供依據，為在蛋白水平上研究MT蛋白打下堅實的基礎。表達載體的宿主菌為 Rossetta，是一種廣泛使用的表達宿主菌，適合于 GST 表達體系，OsMT-1-4c蛋白在此宿主菌中活性穩定且產量高［24］。在IPTG誘導3 h后，目的蛋白得到大量表達，然后純化得到GST-OsMT-1-4c重組蛋白。重金屬抗性分析是通過重金屬Cd2+脅迫含目的基因的菌株，通過目的蛋白的表達，比較表達GSTOsMT-1-4c蛋白與GST蛋白的菌株的生長狀況，結果表明1.0 mmol/L CdCl2處理3 h內，對照菌和重組菌增長沒有明顯差異；處理3 h后，表達OsMT蛋白的重組菌增長率明顯高于對照菌。說明OsMT-1-4c可能與金屬離子相結合，從而使相應的重組菌表現出耐受金屬離子的能力。通過本實驗OsMT-1-4c表達，將為提高對重金屬離子的耐受和毒性提供一個可行的基因策略，為今后在利用生物體抗重金屬修復上提供應用前景［25］。

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（責任編輯 楊賢智）

Vector construction， prokaryotic expression and resistance to heavy metals of OsMT-1-4c

TANG Wei1，ZHANG Mei2，WANG Xiao-lan1
（1.College of Life Science， Guangzhou University，Guangzhou 510006，China；
2.South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，China）

In order to study the resistance of paddy rice to heavy metals， PGEX4T-3-OsMT-1-4c， the prokaryotic expression vector of metallothione for paddy rice was constructed， which was then transformed into strain Rossetta to induce the expression， about 33.643 kDa of GST-OsMT-1-4c fusion protein was obtained. The obtained precipitation was dissolved with 1×PBS and conducted ultrasonic fragmentation at low temperature，followed by the centrifugation and electrophoresis detection， and then was gained through the purification. Furthermore， when the recombinant vector and empty vector strains were induced to express under the stress of heavy metal Cd2+， it was found that the strain to express protein GST-OsMT-1-4c owned stronger resistance to heavy metals than that of protein GST.

rice；metallothionein； prokaryotic expression； purification；resistance to heavy metals

X592

A

1004-874X（2017）01-0008-07

2016-11-01

國家自然科學基金（30971912）

唐偉（1989-），男，在讀碩士生，E-mail：907264698@qq.com

王小蘭（1973-），女，博士，教授，E-mail：1372848641@qq.com

唐偉，張美，王小蘭. OsMT-1-4c基因原核表達載體的構建、表達及重金屬抗性研究［J］.廣東農業科學，2017，44（1）：8-14.