潛在促生菌Bacillus tequilensis U36的產IAA特性及其對辣椒的促生效果

聶 鑫，王 偉

（華東理工大學生物工程學院生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

潛在促生菌Bacillus tequilensis U36的產IAA特性及其對辣椒的促生效果

聶 鑫，王 偉

（華東理工大學生物工程學院生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

對從土壤中分離到的一株潛在根圍促生菌U36進行了系統分析，通過形態學、生理生化特性及16S rRNA分析鑒定其為特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis。盆栽試驗發現，U36對植物生長有促進作用，而且在正常土壤中植株的生長優于無菌土。但就促生效率而言，在滅菌土中加入U36后的促生效率高于正常土中的促生效率：正常土中U36對辣椒根長、根重、莖長、莖重和葉面積的促進效率分別達到47.7%、37.5%、21.5%、69.2%和8.1%；而在滅菌土中，辣椒根長、根重、莖長、莖重和葉面積的促進效率分別為49.2%、58.8%、25.7%、58.2%和24.1%。通過研究發現U36不僅具有固氮、解磷的功能，還可產生促生長物質吲哚乙酸（IAA），且IAA的產生具有色氨酸依賴性。該菌株的優良促生特性可以作為潛在促生菌用于生物肥料研發，具有很好的應用價值。

辣椒；促生菌；Bacillus tequilensis；吲哚乙酸；色氨酸依賴性

植物根圍促生菌（PGPR）是一類在土壤中與植物密切相關的重要微生物，這些微生物的生長活動可以促進宿主植物的生長［1］。自然界中的PGPR種類很多，有些微生物具有直接促進植物生長的功能，如Goswami等［2］研究的Paenibacillus mucilaginosus N3；有些微生物的促生作用機制是基于對一些植物病原菌的拮抗，如我們常見的一些熒光假單胞菌和芽孢桿菌都具有生物防治的效果，從而促進植物生長［3］。對于PGPR的研究和應用一直在不斷發展，特別是近幾年隨著人們生活水平的不斷提高、環保意識的增強以及對化學肥料危害的深入了解，安全無污染的生物農藥和生物肥料成為研究重點。Gopalakrishnan等研究的放線菌對水稻的促生作用［4］以及Paungfoo-Lonhienne等研究的伯克氏菌屬的促生作用［5］都為PGPR的發展和應用奠定了重要基礎。

PGPR的促生機制有多方面，大多數PGPR的促生作用是多種促生機制共同作用的結果。有的菌株具有固氮、解磷和解鉀的功能，從而為宿主植物提供N、P、K等營養元素；有的則通過產生一些促生長的物質如吲哚乙酸（IAA）、氫氰酸、鐵載體等［6］來達到促進植物生長的效果。這些促生機制在很多研究中被用來篩選PGPR，為后續的生物測定以及田間試驗提供參考。IAA是一種常見的植物促生長激素，很多PGPR都可以產生該類物質，但是產生的方式有所不同。Idris等［7］對Bacillus amyloliquefaciens FZB4 產生IAA的機理進行了深入研究，發現其具有色氨酸依賴性。目前，對PGPR促生作用的研究很多，但是就PGPR在正常土壤環境和無菌土壤環境中促生效果的比較研究還未見報道。鑒于此，本研究基于實驗室內篩選到的可能具有促生潛力的菌株Bacillus tequilensis U36（簡稱U36），對它產生IAA的色氨酸依賴性及其在正常土與無菌土中的促生效果進行初步比較，目的是對該菌株可能作為潛在生物肥料的有效成分提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：U36分離自施入了生防菌熒光假單胞菌CPF10的西瓜根圍土壤中。

辣椒：朝天椒（Capsicum frutescens），種子購于徐州一粒籽園藝有限公司。

土壤：上海市亭林地區蔬菜大棚內的辣椒種植土壤，pH 7.76（±0.20），總氮1.23（±0.08）g/kg，有機碳10.41（±1.08）g/kg，有機質1.77（±1.44）g/kg，砂粒（50～2000 μm）17.18%，粉粒（2～50 μm）79.76%，粘粒（＜2 μm）3.16%，土壤質地為黃壤土。土壤取回后自然晾干，過2 mm篩，部分土壤需滅菌處理，滅菌方法參照Delmont等［8］，滅菌后的土壤放置1周后使用。

1.2 試驗方法

試驗于2014年9月在華東理工大學生物工程學院生物反應器工程國家重點實驗室內進行。

1.2.1 U36的鑒定 （1）形態學鑒定和生理生化鑒定：參照文獻［9］和文獻［10］進行鑒定。（2）分子生物學鑒定：將菌株用LB液體培養液培養至對數生長期，離心收集菌體，采用SDS-CTAB法提取總基因組DNA。以總DNA為模板，采用通用引物27F（5＇-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3＇）和1492R（5＇-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3＇）進行16S rRNA的PCR擴增，PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后純化回收并測序（上海生工生物工程科技有限公司），獲得16SrRNA序列后，在GenBank中采用Blast程序搜索同源序列，利用MEGA 4.0軟件建立系統進化樹。

1.2.2 菌株U36促生長作用 試驗設4個處理：（1）滅菌土添加U36；（2）正常土添加U36；（3）滅菌土未添加U36（CK1）；（4）正常土未添加U36（CK2）。每個處理3次重復。辣椒種子先用70%乙醇消毒2 min，再用次氯酸鈉溶液處理2 min，最后用無菌水沖洗10次。將處理后的種子，在無菌水中浸泡1 h后播種于圓形花盆（盆口×盆底×盆高=100 mm×70 mm ×95 mm）中，花盆內含有500 g土，初始含水量為10%（V/W），置于人工植物培養箱（溫度24℃、相對濕度70%、光照12 h/d）中，每隔2 d澆水1次，每次約50 mL，花盆底部放置淺碟，以防止菌淋濾出。試驗菌株U36培養于LB液體培養基中，37℃振蕩培養24 h，菌液離心沉淀后用無菌水稀釋，使最終加入的試驗菌量為1×108CFU/g（按干土量計），播種后將菌液通過灌根的方式加入到土壤中。處理后第40天對辣椒植株進行取樣，測量根重、莖重、根長、莖長和葉面積等生理指標。

1.2.3 菌株U36固氮作用 配制Ashby無氮培養基（KH2PO40.2 g/L、CaCO30.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、NaCl 0.2 g/L、CaSO40.1 g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.0），從LB固體培養基上挑取U36菌株的單菌落在Ashby無氮培養基固體平板上劃線，3次重復，37℃培養箱內培養24 h后進行觀察。如果可以生長，則該菌株可以利用空氣中的氮氣使自己在無氮培養基中生長，具有固氮能力。

1.2.4 菌株U36解磷作用 配制PVK改良培養基〔葡萄糖10 g/L、Ca3PO45 g/L、（NH4）2SO40.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO40.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母粉0.5 g/L、MnSO40.002 g/L、4%溴酚藍6 mL、瓊脂20 g/L、pH自然〕，從LB固體培養基上挑取U36菌株單菌落涂于PVK改良培養基固體平板上，3次重復，37℃培養箱內培養24 h后進行觀察。如果菌落周圍可以產生透明圈，說明該菌株可以溶解不溶的磷酸鈣產生磷元素供菌體生長，具有解磷作用。

1.2.5 菌株U36解鉀作用 配制解鉀培養基（蔗糖5 g/L、Na2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeCl30.005 g/L、CaCO30.1 g/L、鉀長石粉1 g/L、瓊脂20 g/L、pH 7.0～7.5），從LB固體培養基上挑取U36菌株單菌落涂于解鉀培養基固體平板上，3次重復，37℃培養箱內培養24 h后進行觀察。如果周圍有透明圈產生，說明該菌株可以溶解不溶的鉀長石產生鉀元素供菌體生長，具有解鉀作用。

1.2.6 菌株U36產IAA特性 繪制IAA標準曲線：取IAA標品，配置成0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/mL的濃度梯度，取2 mL各濃度IAA加入4 mL索爾克染劑（1 mL 0.5 mol/L FeCl3·H2O加入到50 mL 35%濃H2SO4中），30℃中暗保溫30 min，530 nm下利用分光光度計測定吸光度，以OD值為縱坐標、IAA濃度為橫坐標繪制標準曲線。

將U36與實驗室分離到的另外兩種菌株U12和U40作為對照菌株同時進行試驗。首先，將3種菌株單菌落接種到LB液體培養基中，加入5 mmol/L L-色氨酸、0.06%SDS（十二烷基硫酸鈉）和1%甘油，37℃下180 r/min振蕩培養48 h。取菌液于離心管中10 000 r/min離心5 min，取2 mL上清，加入2滴磷酸和4 mL索爾克染劑。28℃下30 min左右顏色由黃色變為粉紅色則說明顯陽性，檢測到有IAA的產生，并根據標準曲線計算產生的IAA含量。

1.2.7 菌株U36產IAA的色氨酸依賴性 將菌株U36、U12和U40分別接種到LB液體培養基中，置于37℃下180 r/min恒溫振蕩培養箱內培養24 h后作為母液使用。取1 mL菌液接種到新的100 mL LB液體培養基中，設0、250、500 μg/mL L-色氨酸3個處理，每個處理3次重復。處理后同樣條件下振蕩培養，分別在培養后0、1、2、3、4、5 d時取樣，每個樣品3次重復。然后進行IAA色氨酸依賴性檢測，分別取上述菌液于離心管中10 000 r/min離心5 min，取2 mL上清，加入2滴磷酸和4 mL索爾克染劑，28℃下30 min左右顏色由黃色變為粉紅色則說明顯陽性，檢測到有IAA的產生，測定530 nm下的吸光度，根據標準曲線計算IAA濃度。

1.3 數據統計分析

利用SPSS軟件對試驗數據進行方差分析，檢驗其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 菌株U36的鑒定

菌株U36的形態學鑒定及生理生化鑒定結果表明，U36在培養基中呈白色、干燥、粗糙、無光澤狀態，電子顯微鏡下觀察為桿狀，且為革蘭氏陽性。生理生化鑒定發現U36可水解葡萄糖、蔗糖、明膠、淀粉，但不水解乳糖和檸檬酸，甲基紅試驗陽性說明該菌株水解葡萄糖產生丙酮酸并最終被分解為甲酸、乙酸和乳酸等。

對U36進行分子生物學鑒定，16SrRNA測序結果采用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹（圖1）。將16SrRNA的測序結果與GenBank中的核苷酸序列進行同源性比較，發現該菌株序列（GenBank登陸號為HQ223107）與Bacillus tequilensis（10 b）同源性達99.887%，結合生理生化特征，確定菌株U36為特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis。

圖1 U36的系統發育樹

2.2 菌株U36的促生作用

在辣椒生長40 d時測定各項生理指標，結果見表2。由表2可知，U36在正常土和滅菌土中與對照的各個生理指標差異顯著，正常土壤中植株的生長狀況優于滅菌土，但促生效率不同。正常土中U36對根長的促進效率達47.7%，根重促進效率達37.5%，莖長促進效率達21.5%，莖重促進效率達69.2%，葉面積促進效率只有8.1%；而在滅菌土中根長、根重、莖長、莖重和葉面積的促進效率分別為49.2%、58.8%、25.7%、58.2%和24.1%。由此可見，無論是U36處理還是非U36處理中，正常土中的植株生長狀況都比滅菌土中好，在根長、莖長、莖重和葉面積上都有顯著差異。但就總體促生效率而言，在滅菌土中加入U36后的促生效率比正常土中要高，說明U36具有促進植物生長的作用，發揮著重要的生態功能。

表2 U36在正常土與滅菌土中對辣椒生長情況的影響

2.3 菌株U36的固氮、解磷和解鉀特性

通過對U36固氮、解磷、解鉀特性的研究，發現U36表現出了一定的固氮作用和解磷作用，但不具有解鉀的特性。具有固氮和解磷作用可能是U36表現出促生特性的一個重要原因。

2.4 菌株U36的產IAA特性

IAA的標準曲線如圖2所示。通過對發酵液中的IAA進行檢測發現，菌株U36和兩個對照菌株都可產生IAA，但產量不同。在該處理條件下，U12的IAA產量只有22.5（±2.3）μg/mL，U40的IAA產量有58.1（±3.2）μg/mL，而U36的IAA產量達到63.1（±3.7）μg/mL。可見，在這3種菌株中U36的IAA產量最大。

圖2 IAA標準品標準曲線

圖3 U36產生IAA的濃度隨發酵時間的變化

對U36產IAA的色氨酸依賴性試驗結果見圖3。對0、1、2、3、4、5 d的樣品進行IAA檢測的結果表明，該菌株在沒有色氨酸存在的情況下，代謝產物基本檢測不到IAA的產生，而在色氨酸濃度為250、500 μg/mL時可以檢測到IAA的產生。在500 μg/mL色氨酸濃度下，發酵2 d即可達到較高的IAA濃度，然后趨于平緩，而在250 μg/mL色氨酸濃度下約4 d才能達到較高IAA濃度，然后趨于平緩，這可能是培養基中的色氨酸已被完全利用而導致IAA的生成終止，IAA濃度基本保持不變。可見，在高色氨酸濃度條件下生成IAA的效率及其產量可能會更高。

3 結論與討論

PGPR研究是近幾年熱點，越來越多的PGPR菌株被分離出來，利用其促進植物生長的特性被廣泛應用于不同地域、不同環境下的農業生產［11-12］。在PGPR促生機制的研究中，IAA是一種重要的植物激素，是很多PGPR促生特性的重要原因［13］。我們發現本實驗室分離到的U36菌株可以產生IAA，且具有色氨酸依賴性，即在有色氨酸存在的條件下可利用色氨酸產生IAA，且在高色氨酸濃度條件下IAA的生成效率也會提高。這一特性在其他PGPR的研究中也被發現［14-15］，有學者認為這可能與菌株產生IAA時的一些關鍵酶的表達有關［16］。因此，在應用時若補充一些關鍵氨基酸，其在土壤中將發揮更好的促生效果。

U36的促生效果不論在正常土還是無菌土盆栽試驗中的表現都十分突出，這可能源于U36的優良促生特性。產生的IAA直接促進植物生長，固氮特性使其獲得更多的氮源供植物利用，解磷作用幫助植物利用土壤中難以利用的磷元素。我們還發現，植物在正常土中的生長比在無菌土中的生長狀態好，這與國內外一些學者研究的結果有一定的相似性［17］，原因可能有以下幾個方面：首先，我們的研究用土取自蔬菜大棚內的土壤，該土壤環境可能更利于植物的生長，土壤中的很多有益微生物都與植物生長密切相關，所以相同的條件下正常土比無菌土中的植株生長較好；其次，在加入U36以后，U36不僅自身可以產生一些促生長物質直接作用于植物本身，而且可以與土壤中的微生物相互作用，可能增加了有益菌群的數量，同時減少了有害菌群的數量，所以有菌土中辣椒的生長狀況比無菌土好，Wu等［18］的研究也得到相似結果。在無菌土的條件下，U36表現出的促生效率比正常土更好，可能是在無菌土條件下辣椒本身長勢較差，當U36加入后很快定殖，其對植物直接的促生作用得到加強，從而表現出更高的促生效率。

然而，也有少量PGPR的研究與本研究結果不同［19］，他們認為土壤滅菌徹底消除了土壤中的不利生物因素外，高溫滅菌也會使土壤中的某些緩效養分得到釋放［20］，從而使植株的生長得到顯著改善。這種差異可能與研究所用土壤和所用植株的不同有關，不同的研究土壤，其中的微生物群落對不同的植株生長的影響不同。如果土壤原本不利于植物生長，滅菌處理可能會殺滅土壤中的有害菌群；但如果土壤原本的微生物菌群是有利于植物生長的，滅菌處理可能會殺滅大量的有益菌群，從而降低了土壤活力。

［1］ Chauhan H，Bagyaraj D J，Selvakumar G，et al. Novel plant growth promoting rhizobacteria—Prospects and potential［J］. Applied Soil Ecology，2015，95：38-53.

［2］ Goswami D，Parmar S，Vaghela H，et al. Describing Paenibacillus mucilaginosus strain N3 as an efficient plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）［J］. Cogent Food & Agriculture，2015，1（1）：1000714.

［3］ Sivasakthi S，Usharani G，Saranraj P. Biocontrol potentiality of plant growth promoting bacteria（PGPR）-Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis：A review［J］. African Journal of Agricultural Research，2014，9（16）：1265-1277.

［4］ Gopalakrishnan S，Vadlamudi S，Bandikinda P，et al. Evaluation of Streptomyces strains isolated from herbal vermicompost for their plant growthpromotion traits in rice［J］. Microbiological Research，2014，169（1）：40-48.

［5］ Paungfoo-Lonhienne C，Lonhienne T G A，Yeoh Y K，et al. A new species of Burkholderia isolated from sugarcane roots promotes plant growth［J］. Microbial Biotechnology，2014，7（2）：142-154.

［6］ Ma Y，Prasad M N V，Rajkumar M，et al. Plant growth promoting rhizobacteria and endophytes accelerate phytoremediation of metalliferous soils［J］. Biotechnol Adv，2011，29（2）：248-258.

［7］ Idris E S E，Iglesias D J，Talon M，et al. Tryptophan-dependent production of indole-3-acetic acid（IAA）affects level of plant growth promotion by Bacillus amyloliquefaciens FZB42［J］. Mol Plant Microbe Interact，2007，20（6）：19-26.

［8］ Delmont T O，Francioli D，Jacquesson S，et al. Microbial community development and unseen diversity recovery in inoculated sterile soil［J］. Biology and Fertility of Soils，2014，50（7）：1069-1076.

［9］ 東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001.

［10］ 布坎南，吉本斯. 伯杰細菌鑒定手冊［M］. 第8版. 北京：科學出版社，1984.

［11］ Nadeem S M，Ahmad M，Zahir Z A，et al. The role of mycorrhizae and plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）in improving crop productivity under stressful environments［J］. Biotechnology Advances，2014，32（2）：429-448.

［12］ Shinwari K I，Shah A U，Afridi M I，et al. Application of plant growth promoting rhizobacteria in bioremediation of heavy metal polluted soil［J］. Asian Journal of Multidisciplinary Studies，2015，3（4）：179-185.

［13］ Duca D，Lorv J，Patten C L，et al. Indole-3-acetic acid in plant-microbe interactions［J］. Antonie Van Leeuwenhoek，2014，106（1）：85-125.

［14］ Bano N，Musarrat J. Characterization of a new Pseudomonas aeruginosa strain NJ-15 as a potential biocontrol agent［J］. CurrentMicrobiology，2003，46（5）：324-328.

［15］ Atzorn R，Crozier A，Wheeler C T，et al. Production of gibberellins and indole-3-acetic acid by Rhizobium phaseoli in relation to nodulation of Phaseolus vulgaris roots［J］. Planta，1988，175（4）：532-538.

［16］ Oberh?nsli T，Défago G，Haas D. Indole-3-acetic acid（IAA）synthesis in the biocontrol strain CHA0 of Pseudomonas fluorescens：role of tryptophan side chain oxidase［J］. Journal of General Microbiology，1991，137（10）：2273-2279.

［17］ 張曉霞，王平. 對水稻有促生作用的紫云英根瘤菌篩選初報［J］. 土壤肥料，2001（6）：30-33.

［18］ Wu K，Yuan S，Wang L，et al. Effects of bioorganic fertilizer plus soil amendment on the control of tobacco bacterial wilt and composition of soil bacterial communities［J］. Biology and Fertility of Soils，2014，50（6）：961-971.

［19］ 張樹生，楊興明，茆澤圣，等. 連作土滅菌對黃瓜（Cucumis sativus）生長和土壤微生物區系的影響［J］. 生態學報，2007，27（5）：1809-1817.

［20］ Troelstra S R，Wagenaar R，Smant W，et al. Interpretation of bioassays in the study of interactions between soil organisms and plants：involvement of nutrient factors［J］. New Phytologist，2001，150（3）：697-706.

（責任編輯 張輝玲）

IAA production characteristics and growth-promoting effects on pepper of potential plant grouth-promoting rhizobacteria（PGPR）Bacillus tequilensis U36

NIE Xin1，WANG Wei
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，School of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

We systematically analyzed a potential plant growth-promoting rhizobacteria（PGRP）U36，which was separated from soil. This strain was eventually determined to be Bacillus tequilensis through the morphological，physiological and biochemical properties and 16S rRNA assay. Through the pot experiment，we found that U36 promoted pepper growth，which was better in normal soil than in sterilized soil，but the growth promoting efficiency was much higher in sterilized soil than in normal soil after applying U36. In normal soil，the promoting efficiencies of U36 on root length，root weight，stem length，stem weight and leaf area of pepper were 47.7%，37.5%，21.5%，69.2% and 8.1%，respectively. While in sterile soil，the promoting efficiencies were 49.2%，58.8%，25.7%，58.2% and 24.1%，respectively. Besides，U36 not only had the functions of nitrogen fixation and phosphate-solubilizing，but also could produce the growth promoting substance IAA，and the generation of IAA had tryptophan dependence. With the excellent growth-promoting effect，U36 can be used as a potential PGPR for the development of biological fertilizer，which has a good application value.

pepper；plant growth-promoting rhizobacteria（PGPR）；Bacillus tequilensis；IAA；tryptophan dependence

S758.2

A

1004-874X（2017）01-0036-07

2016-10-28

上海市科技創新行動計劃重點攻關項目（15391901500）

聶鑫（1990-），男，在讀碩士生，E-mail：niexin19901203@sina.com

王偉（1963-），男，博士，教授，E-mail：weiwang@ecust.edu.cn

聶鑫，王偉. 潛在促生菌Bacillus tequilensis U36的產IAA特性及其對辣椒的促生效果［J］.廣東農業科學，2017，44（1）：36-42.