壁虎醇提物急性毒性研究

郭夢麗，王建剛，靳 穎，段一夢

壁虎醇提物急性毒性研究

郭夢麗，王建剛，靳 穎，段一夢

目的 觀察壁虎醇提物對小白鼠的急性毒性作用。方法 運用急性毒性的實驗進行半數致死量(LD50)的計算。預實驗用較大范圍壁虎醇提物試液少量動物進行實驗求出致死范圍，然后在全數致死量和零致死量之間將實驗用小白鼠分為5組，計算各組劑量公比，每組10只雄性小白鼠，進行正式實驗，將實驗結果記錄后運用改良寇氏法進行計算。結果 灌胃給予壁虎醇提物，小鼠無死亡出現，但活動減少，反應遲鈍，1 h后恢復正常，小白鼠每日灌胃的最大耐受量(MTD)為48.0 g·kg-1。經腹腔注射給藥的LD50為6.475 g·kg-1，95%可信限為6.862～6.088 g·kg-1。結論 壁虎醇提物毒性極小，臨床應用相對較安全。

壁虎醇提物；急性毒性試驗；半數致死量；最大耐受量

壁虎作為一種傳統中藥具有祛風定驚、散結解毒的功能[1]。現代藥理學研究發現壁虎有抑制惡性腫瘤、改善組織中血液供應、抑菌、降低血壓、平喘等作用，很具藥物開發潛力[2]。目前，隨著壁虎逐漸應用于臨床，其藥理作用已有不少報道[3]，但其成分復雜，對于測定壁虎的急性毒性作用及安全用量的研究還不是很豐富。本研究用改良寇氏法測定壁虎醇提物半數致死量(median lethal dose，LD50)，研究壁虎醇提物的急性毒性作用，為進一步開發壁虎藥用價值及其臨床應用提供依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑與藥品 多疣壁虎粉(安徽省亳州市永剛飲業廠有限公司，批號：090301，經河南科技大學醫學院實驗動物中心王曉利高級實驗師鑒定)。

1.1.2 實驗用動物 雄性BALB/c小鼠，120只，體質量18～24 g，河南科技大學醫學院實驗動物中心提供(合格證號scxk2015-0007)。

1.1.3 主要儀器 電子分析天平(上海梅特勒—托利多儀器有限公司)、高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技有限公司)、L50膠體磨(上海諾尼輕工機械有限公司)、旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器公司)、加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)、PHS-3C型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)、冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)、KQ-250E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 壁虎醇提物的制備 取壁虎干粉(多疣壁虎粉)100 g溶解于蒸餾水500 mL中，用磁力攪拌器攪拌至全部溶解為無團狀粉末，用膠體磨研磨 4 h。取出膠體磨中勻漿液，置于離心管中，用高速離心機5 500 r·min-1離心5 min，棄去上清，取所剩沉淀。將沉淀用蒸餾水溶解，定容至300 mL，加入無水乙醇367 mL(使乙醇終濃度為55%)攪拌均勻后置4 ℃冰箱，每隔0.5 h攪拌1次(攪拌4 h)后，置于離心管中，用高速離心機5 500 r·min-1離心5 min，棄去沉淀，取上清，用真空旋轉蒸發儀旋轉蒸發(水浴鍋溫度控制在50 ℃)，蒸去酒精(可回收再利用)，負壓冷凍干燥機凍干得到壁虎醇提物干粉[4]。

1.2.2 灌胃給藥LD50及最大耐受量測定 配制不同濃度(800、667、600、556、500、463 mg·mL-1)壁虎醇提物試液，然后將禁食12 h的小鼠進行灌胃給藥(分別以0.3 mL·10 g-1劑量用1 mL 注射器將新配制的不同濃度壁虎醇提物灌胃)，空白組小鼠等體積注射用水灌胃，每日給藥2次，每次間隔12 h，給藥后小鼠常規飼養，自由飲水，自然光照，室溫20～25 ℃，相對濕度60%。連續觀察7 d小鼠的毒性反應，包括行為活動、精神狀態、食欲、大小便、呼吸，口、鼻、眼、耳、肛門等有無異常分泌物，毛發、體質量變化及死亡等情況。使用小鼠能夠耐受而不引起死亡的最大耐受量(maximum tolerated dose,MTD)[5]。第8日對未死亡小鼠進行稱重并斷頸處死，觀察小鼠內臟器官的變化。

1.2.3 腹腔注射給藥LD50的測定 配制不同濃度(800、714、650、600、550、500 mg·mL-1)壁虎醇提物，然后以0.1 mL·10 g-1劑量用2.5 mL注射器分別將新配制的不同濃度的壁虎醇提物腹腔注射，預實驗得引起動物0%死亡的劑量(most non lethal dose, Dn)=0.0500 g·10 g-1，引起動物100%死亡的劑量(minimum lethal dose, Dm)=0.080 g·10 g-1。

根據預實驗測試結果，在Dn=500 mg·mL-1和Dm=800 mg·mL-1的劑量范圍內設置5個劑量組，各劑量組的動物相等。組間劑量比值(1∶r)。在0%和100%死亡劑量范圍內，各劑量組的公比如下式：

公式中n為分組數，則各組劑量分別是Dn，Dn·r，Dn·r2，Dn·r3，Dn·r4。由上述預實驗可得出各劑量組的公比r=1.12。各組劑量分別為0.050、 0.056、0.063、0.071、0.080g·10g-1。

將實驗小鼠隨機分組標號并準確稱重記錄，以0.1mL·10g-1劑量對小鼠進行腹腔注射。空白組小鼠腹腔注射等體積注射用水。在注射2、4、8、16h，第2、3、4、5、6、7 日分別記錄小鼠生存狀況及體質量變化，采用改良寇氏法測定壁虎醇提物的LD50。實驗7d后，對未死亡小鼠進行斷頸處死，觀察小鼠內臟器官的變化(死亡率觀察時間：根據藥物作用快慢，觀察10～30min、24～72h，個別為7d。最小劑量藥物組的死亡率不得超過20%，而最大劑量藥物組的死亡率不得少于80%)。

2 實驗結果

2.1 灌胃給藥 由于測不出壁虎醇提物的LD50，而其試液最大濃度為0.8g·mL-1，實驗組小白鼠按最大給藥體積0.3mL·10g-1給藥，全部存活，與空白組對照未見任何異常狀況，均活動自如。觀察7d，第8日稱體質量后處死實驗組小白鼠，解剖發現胃充盈，腸無脹氣。解剖肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、胃、腸及胸腔、腹腔等器官均無異常。給藥前體質量為(24.40±1.60)g，第8日體質量為(28.70±2.40)g。測定出小白鼠每日灌胃的最大耐受量為48.0g·kg-1。

2.2 腹腔注射給藥

2.2.1 小鼠死亡情況 最小劑量藥物組的死亡率不得超過20%，而最大劑量藥物組的死亡率不得少于80%。本實驗小白鼠死亡情況結果見表1。當壁虎醇提物注射劑量為5 000mg·kg-1時，該組小鼠無死亡，說明在此濃度下壁虎醇提物對小鼠毒性極小。當壁虎醇提物注射劑量為8 000mg·kg-1時，該組小鼠全死亡，說明在此濃度下壁虎醇提物對小鼠毒性較大。

表1 急性小鼠毒性實驗結果

注：LgD即為注射劑量D以10為底的對數。

2.2.2 計算LD50(改良寇氏法) LD50=log-1[Xm-i(ΣP-0.5)](mg·kg-1)。式中Xm為最大劑量的對數(3.903)，ΣP為各組動物死亡率總和(230%)，i為相鄰兩組劑量的對數之差(0.05104)或相鄰兩組劑量比值的對數。將上列各組數代入公式得：LD50=log-1[3.903-0.051 (2.3-0.5)](mg·kg-1)=log-13.811=6474.68(mg·kg-1)≈6.475(g·kg-1)

2.2.4 小鼠體質量變化 在注射2、4、8、16 h，第2、3、4、5、6、7 日分別記錄小鼠的體質量變化，結果發現，與對照小鼠體質量的變化相比，給藥組小鼠隨著時間的增加體質量均有增加(若死亡較多則不計平均體質量)。

2.2.5 毒性反應表現 給藥后開始出現自發活動明顯減少、嗜睡、反應遲鈍、不喜動、少食、步履不穩、共濟失調、雙側上瞼明顯下垂；2 h后大劑量組小鼠毒性表現加重，拒食，并出現呼吸困難；4 h后大劑量組小鼠開始出現呼吸抑制、震顫、驚厥，甚至出現了中毒死亡現象。給予實驗小鼠注射壁虎醇提物的劑量越大，小鼠的毒性癥狀則出現得越早且越重，小鼠的死亡率相應越高，且死亡時間相應越短。與對照小鼠解剖后的各內臟器官的變化比較說明實驗小鼠腹腔無感染，且小鼠死亡前體質量均有增加。

3 討論

隨著癌癥發病率和死亡率的逐年升高，尋找高效并且低毒的抑制癌癥的方法或藥物有著相當重要的現實意義。常規的化療方案常伴隨有嚴重的毒副反應及耐藥現象，如胃腸道反應、骨髓抑制、免疫功能降低等，限制了全程劑量的使用，從而影響療效[6-9]。近年來，開發無毒副作用的天然藥物治療癌癥已成為眾多研究者的焦點[10]。壁虎作為傳統中藥治病已有悠久的歷史[11-13]。壁虎有解毒消堅、排膿生肌作用，對多種惡性腫瘤，尤其是乳腺癌、胃癌、肺癌、宮頸癌肝癌、食管癌等都有很好的療效[14]。根據大量關于壁虎的臨床報道顯示，壁虎抑制消化道腫瘤具有獨特的療效，且毒副作用相對較小[15]。因此，壁虎在癌癥防治方面具有一定的臨床應用價值。壁虎的化學成分經氨基酸測定含有17種氨基酸:甘氨酸、谷氨酸、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等，水溶部分經灰化后火焰光譜分析含有18種微量元素(錳、磷、銀、鈉、鉀、鐵、鈣等)，并含維生素C、D和鋅。另有研究發現壁虎中還含有水分、灰分、粗蛋白、胡蘿卜素、粗纖維、脂肪等[3]。

由于壁虎有效成分的提取和制備方法不同，其成分、含量和穩定性不同，急性毒性不同，作用也不同，比如壁虎中所含抗腫瘤有效成分的類別、結構、性質等尚不明確，在一定程度上限制了壁虎的開發與使用[16]，還有待進一步的研究。

本次對壁虎醇提物的急性毒性研究中，灌胃給藥結果顯示，壁虎醇提物的毒性較小，但能夠引起小鼠食欲減退。腹腔注射給藥結果顯示，低濃度藥物的毒性作用較小，不會引起小鼠死亡。給藥后短期內實驗小鼠食欲不振，精神萎靡，4 h后小鼠狀態逐漸恢復正常；但隨著藥物濃度的增加，開始出現死亡現象，死亡前小鼠眼睛模糊、精神不振，甚至出現驚厥。經改良寇氏法計算出的半數致死量顯示壁虎醇提物的毒性不大。兩種給藥途徑小鼠均出現食欲不振、運動失調、眼睛模糊、反應低下等不良反應。但其毒性較小，不會對藥效產生太大影響。本研究測定壁虎醇提物經灌胃給藥對小白鼠無明顯毒性作用。經腹腔注射的LD50為6.475 g·kg-1，說明壁虎醇提物的給藥途徑不同，其毒性及其表現也不同。因此，臨床應用時口服給藥較注射給藥安全，副作用相對腫瘤化療藥來說較小[17]。本實驗中所用的壁虎醇提物的提取方法為無水乙醇提法[18]，提取方法不同可能導致其有效活性成分發生變化，應對比不同提取方法的壁虎醇提物的急性毒理進行實驗研究。而且，壁虎醇提物對小鼠的毒性作用部位靶器官，需要在慢性毒理實驗中進一步明確。

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Acute Toxicity of Alcohol Extract from Gecko with Mice

GUO Meng-li, WANG Jian-gang, JIN Ying, DUAN Yi-meng

(Key Laboratory of Pharmacology and Medical Molecular Biology,Medical College, Henan University of Science and Technology,Luoyang 471000,China)

ObjectiveTo investigate the acute toxicity of alcohol extract from gecko with mice.MethodsThe median lethal dose (LD50) was investigated by using acute toxicity test. A small amount of mice with large dose range administration of alcohol extract from gecko were used to find out the lethal range in preliminary experiment, and between total and zero lethal dose experimental male mice were divided into five groups(10 male mice per group) and the dose ratio of each group was calculated. The results were calculated with improved Kou′s method.ResultsNo death appeared in mice with intragastric administration, and reduction of activities and languishment were found during one hour after administration. The maximum tolerated dose (MTD) of was 48.0 g·kg-1. LD50 by intraperitoneal injection was 6.475 g·kg-1in mice and 95% confidence limit was 6.862～6.088 g·kg-1.ConclusionThis study suggested that alcohol extract of gecko was very small toxicity and relative safe in clinical application.

gecko alcohol extract；acute toxicity test；median lethal dose；maximum tolerated dose

1672-688X(2017)01-0004-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2017.01.02

河南省科技重點攻關基金資助項目(102102310063)

2016-10-18

河南科技大學醫學院，藥理學與分子生物學實驗室，河南洛陽 471003

郭夢麗(1993—)，女，河南駐馬店人，從事腫瘤藥理研究。

王建剛(1961—)，男，教授，E-mail：ylwjg@163.com

R285.5

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