環(huán)狀RNA(circRNA)在腫瘤中的研究進展

魯菱嬌，張艷亮 綜述；段勇 審校

引言

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的特殊非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)。上世紀的70年代，人們在研究RNA病毒時發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA[1，2]。然而，在circRNA被發(fā)現(xiàn)后的很長一段時間里，由于檢測技術(shù)的限制，能檢測出的circRNA量非常少，因此circRNA并未引起人們的重視。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，人們通過測序檢測到了各種生物體內(nèi)表達的circRNA的數(shù)量實際上是非常龐大的，甚至超過相應(yīng)線性RNA的10倍之多。

20世紀初，Salmena L等[3]提出了競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)假說，即各種類型的RNA轉(zhuǎn)錄物具有相同miRNA反應(yīng)元件(miRNA response elements，MREs)， 可 競 爭 性 結(jié)合相同的miRNA，從而影響游離miRNA的表達水平，在轉(zhuǎn)錄后水平進行調(diào)控。兩年后，Hansen TB等[4]提出circRNA具有類似于miRNA海綿的作用，其可吸附miRNA，從而影響所吸附miRNA對其靶mRNA的作用。由此我們可推導(dǎo)RNA家族中存在著互相調(diào)控的關(guān)系，即：circRNA→miRNA→mRNA。大量研究表明，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用，而基于circRNA可吸附miRNA的功能，我們可猜測，circRNA在調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中也具有不容忽視的作用。

1 circ RNA的結(jié)構(gòu)、特征及功能

1.1 circRNA的結(jié)構(gòu)、特征 cicrRNA不同于線性RNA，其大多是由編碼蛋白基因的前體mRNA可變剪接產(chǎn)生的，ciricRNA的5'端和3'端直接頭尾相接形成環(huán)狀閉合結(jié)構(gòu)，因此circRNA既無5'端的帽子結(jié)構(gòu)，也無3'端的多聚A尾結(jié)構(gòu)，因為缺乏自由端，因此不能被核酸內(nèi)切酶降解，比線性RNA更穩(wěn)定[5，6]。cicrRNA在真核生物中高度表達，穩(wěn)定存在于細胞胞漿內(nèi)，大多數(shù)由外顯子序列構(gòu)成[7，8]，也有少部分是由內(nèi)含子序列構(gòu)成，其種類具有跨物種保守性，其表達具有組織、時間特異性。

1.2 circRNA的功能 (1)circRNA可作為海綿吸附miRNA是circRNA第一個被認知的功能。在對circRNA 的研究中[4，5]，Memczak S 等提出 circRNA通過自身的miRNA反應(yīng)元件(MREs)與mRNA競爭性結(jié)合miRNA，解除miRNA對靶mRNA的抑制作用，使靶mRNA的翻譯得以進行，由此可見，circRNA可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相應(yīng)mRNA的表達水平[9]。

(2)circRNA可通過與其他RNA堿基互補配對進而調(diào)控其他RNA水平，例如，小腦變性相關(guān)蛋白1反義轉(zhuǎn)錄物 (antisense to the cerebellar degen-eration-related protein transcript，CDR1as) 能 與CDR1 mRNA互補配對，從而增強CDR7 mRNA的穩(wěn)定性[10]。CDR1as可結(jié)合靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′untranslated region，3′UTR)，抑制靶 mRNA 的作用，從而對其表達進行調(diào)控[5]。

(3)circRNA能與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成RNA-蛋白復(fù)合物，以此調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的活性[4，5，11-13]，例如，CDR1as能與阿格蛋白(Argonaute，AGO)緊密結(jié)合[4，5]；Yang W 等[13]發(fā)現(xiàn)，circ-Foxo3 不僅具有吸附大量miRNAs的海綿樣作用，circ-Foxo3還可與不同的蛋白相結(jié)合[10，14，15]。 由此可見，circRNA 既可以通過結(jié)合miRNA間接調(diào)控蛋白的功能，又可以通過直接與蛋白結(jié)合而影響蛋白的功能。

(4)circRNA也可以作為翻譯的模板指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成[16，17]，Wang Y 等[18]發(fā)現(xiàn)，在體外細胞實驗中瞬時轉(zhuǎn)入circRNAGFP，可以翻譯成具有完整功能的GFP蛋白，并且這種蛋白可在瞬轉(zhuǎn)后的幾天內(nèi)持續(xù)存在。

(5)circRNA能與pre-mRNA競爭，直接調(diào)控母基因表達[19]。在細胞核中，circRNA還可通過與RNA polyII相互作用，調(diào)控母基因的表達[19，20]。

2 circ RNA與腫瘤

circRNA因具有穩(wěn)定、組織表達特異性等特性，因此更具有成為腫瘤標志物的潛力，其在腫瘤診斷、治療方面的運用價值受到越來越多的關(guān)注。人們分別在肺癌、胃癌、肝癌等腫瘤中發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的特異性表達的circRNA。

2.1 肺癌 田芳等[21]對6株非小細胞肺癌（NSCLC）細胞系進行研究后發(fā)現(xiàn)，circHIPK3在6株NSCLC細胞株中均有表達，其中H2170表達最高，H1299表達最低。當干擾circHIPK3時，明顯抑制NCIH2170細胞增殖，而過表達circHIPK3可促進NCI-H1299細胞增殖。且過表達circHIPK3能夠上調(diào)類胰島素1號增長因子（insulin-like growth factors-1，IGF-1）的表達水平，干擾circHIPK3導(dǎo)致IGF-1表達水平下調(diào)。Zhu X等[22]用芯片篩選出肺腺癌組織中特異性表達的circRNAs，發(fā)現(xiàn)差異表達的circRNAs中上調(diào)的有39個，而下調(diào)的有20個，并進一步證實了hsa_circ_0013958在所有的肺腺癌患者的癌組織、血漿中均顯著上調(diào)，他們還發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0013958的表達水平與肺腺癌的TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，通過細胞功能實驗發(fā)現(xiàn)，敲減hsa_circ_0013958后可促進肺腺癌細胞的增殖和侵襲，并抑制細胞凋亡。此外，hsa_circ_00139 58還可發(fā)揮其海綿作用吸附miR-134，以此阻礙miR-134對cyclinD1的抑制作用，而cyclinD1在非小細胞肺癌的發(fā)展中具有重要作用。Yao JT等[23]對101位NSCLC患者的癌和癌旁正常組織進行circRNA_100876的表達驗證，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的癌組織顯著上調(diào)，且與NSCLC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期有關(guān)，他們提出circRNA_100876可能作為NSCLC潛在的生物學(xué)標志物或NSCLC的治療靶點。

2.2 胃癌 Lai ZY等[24]對胃癌組織和癌旁組織差異表達的mRNA和差異表達的circRNA的檢測，通過 分析發(fā)現(xiàn) hsa_circ_0047905、hsa_circ_0138960和has-circRNA7690-15在胃癌組織中高表達，且在 胃 癌 細 胞 中 敲 減 hsa_circ_0047905，hsa_circ_0138960和 has-circRNA7690-15后，均可造成相應(yīng)基因的表達下調(diào)，功能實驗發(fā)現(xiàn)，在體外抑制這三種circRNAs可抑制胃癌細胞系的增殖和侵襲。這些均提示hsa_circ_0047905、hsa_circ_0 138960和has-circRNA7690-15可能在胃癌的形成過程中起到促進作用。Huang M等[25]首先在20對胃癌及癌旁正常組織驗證hsa_circ_0000745的表達，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000745在胃癌組織中下調(diào)，再擴大樣本量分別驗證60例胃癌患者的胃癌組織和血漿中hsa_circ_0000745的表達情況，發(fā)現(xiàn)無論在胃癌組織中還是血漿中，hsa_circ_0000745均出現(xiàn)下調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而通過ROC曲線證實血漿中hsa_circ_0000745與癌胚抗原CEA聯(lián)合檢測對胃癌具有良好的診斷價值。此外，也有證據(jù)表明 circular RNA LARP4[26]、hsa_circ_100269[27]、hsa_circ_0001895[28]在胃癌組織中出現(xiàn)下調(diào)，表明某些circRNA在胃癌的發(fā)展中具有重要作用。

2.3 乳腺癌 Zhang CL等[29]對兩組不同泌乳時期的老鼠的乳腺組織進行circRNA種類的測定，發(fā)現(xiàn)不同泌乳期表達相同種類的circRNA僅占少數(shù)，而兩個時期檢測到circRNA種類大多數(shù)不同，表明在不同的泌乳期，circRNA的表達具有特異性，由此，研究人員推測，circRNA可為各種類型的乳腺癌的比較提供基礎(chǔ)，且對于特定的乳腺癌或乳腺發(fā)育時期，我們都可以篩選出特異性的circRNA來進行檢測。He R等[30]通過circRNA芯片篩選了三陰乳腺癌細胞系與人乳腺上皮細胞中差異表達的circRNA，發(fā)現(xiàn)circGFRA1在三陰乳腺癌細胞系中高表達，通過qPCR驗證了circGFRA1在三陰乳腺癌細胞系和222例三陰乳腺癌患者樣本中的表達情況，進行生存分析后發(fā)現(xiàn)高表達circGFRA1的預(yù)后更差，他們還發(fā)現(xiàn)敲減circGFRA1后可抑制細胞增殖并促進細胞凋亡，預(yù)測分析結(jié)合熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)circGFRA1與GFRA1均可結(jié)合miR-34a，且 circGFRA1與GFRA1的表達存在相互調(diào)控的機制。Yin WB等[31]通過對5例乳腺癌和健康志愿者對照組的外周血總circRNA的芯片分析，篩選出差異倍數(shù)超過2倍的circRNA分子有41個，其中19個上調(diào)，再通過擴大樣本量對20例乳腺癌患者的血清進行qPCR驗證和ROC曲線分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001785可能在乳腺癌的診斷中有一定價值。

2.4 肝癌 Qin M等[32]對89對肝細胞癌和癌旁組織中的hsa_circ_0001649的進行分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001649在肝癌組織中顯著下調(diào)，此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌中，hsa_circ_0001649表達與腫瘤大小和腫瘤栓子的發(fā)生有關(guān)系，這些也提示了hsa_circ_0001649可能作為肝細胞癌的一個潛在的新的生物標志物，并在肝細胞癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起到重要作用。Shi L等[33]運用高通量分析了肝癌細胞中雄激素受體（androgen receptor，AR）對circRNAs表達的影響，發(fā)現(xiàn)AR通過上調(diào)RNA編輯酶ADAR1 p100抑制circRNA的表達，AR轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到ADAR1的啟動子區(qū)可上調(diào)ADAR1的表達，進一步調(diào)控下游circARSP91表達，circARSP91可分別在體內(nèi)和體外抑制肝癌細胞的生長，他們還發(fā)現(xiàn)高表達ADAR1的肝癌患者預(yù)后不良并且與AR表達正相關(guān)，這表明了雄激素受體AR通過ADAR1抑制肝癌細胞中circRNA表達的分子機制，對肝癌的診斷和治療具有潛在的意義。

2.5 宮頸癌 Wang H等[34]分析了3例HPV16感染誘發(fā)的宮頸癌和對應(yīng)癌旁組織的全轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)99種差異表達的circRNAs。Gao YL等[35]通過分析4對宮頸癌組織circRNAs芯片，篩選出45個高表達4倍以上的circRNAs分子，再進一步擴大樣本量在35對宮頸癌樣本中進行qPCR驗證hsa_circ_001828的表達情況，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001828在宮頸癌組織中顯著高表達，體內(nèi)外實驗均證明敲減hsa_circ_001828后可抑制宮頸癌細胞的增殖和侵襲遷移能力，此外，他們通過生物信息學(xué)預(yù)測及熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)hsa_circ_001828可競爭性結(jié)合miR-497從而發(fā)揮原癌基因的功能。

2.6 大腸癌 Wang X等[36]設(shè)計不同的引物擴增hsa_circ_001988，并進行測序驗證，認為hsa_circ_001988可能成為結(jié)直腸癌診斷的一種新的潛在的生物標志物并有望成為一個潛在的新的治療靶點。

3 展望

circRNA的特異性結(jié)構(gòu)賦予了其獨特的功能，多項研究均發(fā)現(xiàn)circRNA參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，作為ceRNA網(wǎng)絡(luò)中不可缺少的信息分子，其在體內(nèi)不僅調(diào)控腫瘤的發(fā)病過程，也廣泛參與其他非癌癥疾病的發(fā)病過程。目前已知，circRNA分子具有物種、組織、時序特異性，并且高度保守、穩(wěn)定，這些特性提示我們，circRNA具有作為新一代腫瘤監(jiān)測的特異性標志物的潛力；同時，circRNA可直接與miRNA、靶基因以及結(jié)合蛋白相互作用，在轉(zhuǎn)錄后水平進行調(diào)控，為靶向治療腫瘤疾病提供了參考。目前，對circRNA在體內(nèi)的作用機制的研究較少，雖然已經(jīng)有研究證實某些circRNA與某些特定腫瘤相關(guān)，但將circRNA作為某種腫瘤特異性標志物，運用在臨床診斷腫瘤上仍然需要進一步的探索。