糖尿病大鼠表皮組織表皮干細(xì)胞的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6表達(dá)變化

李亞蓉，毛紅，趙湜，周玲

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢430014)

糖尿病大鼠表皮組織表皮干細(xì)胞的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6表達(dá)變化

李亞蓉，毛紅，趙湜，周玲

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院，武漢430014)

目的觀察糖尿病(DM)大鼠表皮組織表皮干細(xì)胞(ESCs)中β-連環(huán)素(β-catenin)、周期蛋白D1(Cyclin D1)、Wnt通路蛋白1(Wnt-1)、細(xì)胞角蛋白K6表達(dá)變化，探討DM大鼠ESCs結(jié)構(gòu)和功能變化的機(jī)制。方法將30只大鼠隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，各15例。觀察組用鏈脲佐菌素法制作DM模型，對(duì)照組常規(guī)飼養(yǎng)。造模成功28 d后取兩組大鼠表皮組織，分離ESCs，采用免疫組化SP法測(cè)算兩組ESCs的β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性表達(dá)率和β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性染色積分光密度值(IA)。結(jié)果觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.07%、16.89%、15.51%、14.67%，對(duì)照組分別為72.04%、68.91%、65.08%、57.13%，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性表達(dá)率相比P均<0.05。觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性染色I(xiàn)A分別為74.41±6.17、68.25±5.79、31.67±6.09、60.54±26.72，對(duì)照組分別為117.34±10.05、109.45±7.67、72.42±7.98、125.54±30.14，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性染色I(xiàn)A相比P均<0.05。結(jié)論DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6表達(dá)降低，這可能是DM大鼠ESCs結(jié)構(gòu)和功能變化的機(jī)制。

糖尿病；表皮干細(xì)胞；β-連環(huán)素；周期蛋白D1；Wnt通路蛋白1；細(xì)胞角蛋白；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

糖尿病(DM)患者的皮膚創(chuàng)傷面具有難愈合或不愈合的特點(diǎn)，治療棘手[1]。表皮干細(xì)胞(ESCs)具有生成新皮膚及附屬組織、修復(fù)創(chuàng)傷口、促進(jìn)表皮良性異化的功能，是皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中的重要細(xì)胞[2，3]。DM患者表皮組織中ESCs結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致其功能降低，但其機(jī)制并不明確[4]。β-catenin是一種調(diào)節(jié)表皮ESCs分化的重要細(xì)胞因子，周期蛋白D1(Cyclin D1)、Wnt通路蛋白1(Wnt-1)、細(xì)胞角蛋白K6是其下游靶基因表達(dá)的蛋白[5]。DM大鼠表皮組織ESCs結(jié)構(gòu)和功能的變化可能與β-catenin及其下游cyc1inD1、Wnt-1、K6表達(dá)變化有關(guān)。本研究觀察了DM大鼠ESCs中β-catenin、cyc1inD1、Wnt-1、K6表達(dá)變化，探討DM大鼠ESCs結(jié)構(gòu)和功能變化的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 30只實(shí)驗(yàn)SD雄性大鼠購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，體質(zhì)量300～360 g，實(shí)驗(yàn)前均于培養(yǎng)室內(nèi)喂養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度50～60%。鏈脲佐菌素購(gòu)自上海士鋒生物科技有限公司，β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1抗體試劑均購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司，K6抗體購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司，免疫組織化學(xué)SP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋公司，免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB試劑盒、PBS、檸檬酸鈉溶液均購(gòu)自上海金標(biāo)公司，K-SFM培養(yǎng)基、胎牛血清素購(gòu)自英國(guó)Gibco公司，Ⅳ型膠原購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，免疫定量ELISA分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司。BHC-1300IIA2超凈無(wú)菌工作臺(tái)購(gòu)自蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司，GTR16-2高速離心機(jī)購(gòu)自北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司，DM1000顯微鏡購(gòu)自德國(guó)徠卡公司，奧林巴斯CX31數(shù)碼圖像系統(tǒng)購(gòu)自日本奧林巴斯公司，KD-202A石蠟切片機(jī)購(gòu)自西安金馬醫(yī)療器械有限公司，穩(wěn)步血糖測(cè)定儀購(gòu)自美國(guó)強(qiáng)生公司。

1.2 大鼠分組及DM模型建立方法 將30只大鼠隨機(jī)分為分為觀察組及對(duì)照組，每組15只。觀察組大鼠采用鏈脲佐菌素建立DM模型，具體方法如下[6]：大鼠腹部注射55～60 mg/kg鏈脲佐菌素溶液，正常喂食、喂水2 d后每日測(cè)血糖，連續(xù)3次血糖高于6.8 mmol/L且大鼠現(xiàn)飲食、飲水、排尿多但體型消瘦判定為造模成功。觀察組均造模成功，然后繼續(xù)飼養(yǎng)28 d。對(duì)照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 表皮組織ESCs分離方法 在無(wú)菌環(huán)境下用手術(shù)刀切取兩組大鼠尾背部表皮，無(wú)菌碘液棉簽擦凈所取標(biāo)本，生理鹽水沖洗10 min，放置在超凈工作臺(tái)上[9]，手術(shù)刀逐次清除多余結(jié)締及皮下組織；放入無(wú)菌培養(yǎng)皿，分別青霉素G溶液1次×3 min、D-Hank′s溶液2次×3 min漂洗。切表皮標(biāo)本約為0.5 cm×0.5 cm碎塊，放入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入5 mL的0.25～0.3%胰蛋白酶+EDTA溶液，放入4 ℃冰箱培養(yǎng)12 h。取出放入培養(yǎng)皿內(nèi)，滴加約2 mL PBS，再次D-Hank′s 溶液2次漂洗3 min，后將標(biāo)本表皮層剝離粉碎，放入無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，再次D-Hank′s溶液吹打5～7次，標(biāo)本混合篩網(wǎng)過(guò)濾，清液進(jìn)入離心管，1 200 r/min離心5min。棄上清后作細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)細(xì)胞，將懸液滴入培養(yǎng)板于37 ℃、5%CO2、100%濕度中培養(yǎng)20 min，去培養(yǎng)液及未勃附細(xì)胞，滴入有ESCs培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿，于37 ℃、5%CO2、100%濕度中培養(yǎng)，換液1次/3 d，直到約70%～80%ESCs細(xì)胞1∶3融合傳代，棄培養(yǎng)液，PBS洗3次，滴0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA溶液調(diào)細(xì)胞溶液為懸浮狀態(tài)，30 s內(nèi)滴入10% 胎牛清血素，1 200 r/min離心5 min，去分離上層液，滴入K-SFM培養(yǎng)基，吹打、重懸后接種于培養(yǎng)瓶，去未貼壁細(xì)胞。

1.4 ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法。兩組ESCs培養(yǎng)24 h后，取細(xì)胞密度1×105/mL培養(yǎng)液滴入玻片，PBS浸3次，每次 3 min，90%乙醇固定20 min，PBS浸3次，每次3 min，加0.5% 曲拉通X-100孵育15min，PBS浸3 次× 3 min/次，滴40 mL 3%H2O2阻斷液，25 ℃條件下孵育10 min，PBS洗滌3 次× 3 min/次，滴50 μL一抗覆蓋切片，入37 ℃水浴箱育30 min，PBS洗3次×3 min/次，滴二抗，PBS洗3次，2 min/次，DAB顯色及蘇木素復(fù)染，乙醇脫水干燥切片。Ⅳ型樹膠封固。倒置相差顯微鏡下觀察(400×)，β-catenin陽(yáng)性染色為細(xì)胞膜上棕黃色顆粒，cyclinD1陽(yáng)性染色為細(xì)胞核棕黃色顆粒，K6和Wnt-1陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)棕黃色顆粒。隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性表達(dá)率。對(duì)染色切片進(jìn)行拍照，用奧林巴斯CX31數(shù)碼圖像分析系統(tǒng)測(cè)算β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性染色積分光密度值(IA)。

2 結(jié)果

觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性表達(dá)率分別為15.07%、16.89%、15.51%、14.67%，對(duì)照組分別為72.04%、68.91%、65.08%、57.13%，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性表達(dá)率相比P均<0.05。觀察組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性染色I(xiàn)A分別為74.41±6.17、68.25±5.79、31.67±6.09、60.54±26.72，對(duì)照組分別為117.34±10.05、109.45±7.67、72.42±7.98、125.54±30.14，兩組大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、Cyclin D1、Wnt-1、K6陽(yáng)性染色I(xiàn)A相比P均<0.05。

3 討論

目前全球DM患者人數(shù)接近2.8億，我國(guó)DM患者人數(shù)處于全球第二位[13，14]，并呈現(xiàn)不斷增多的態(tài)勢(shì)，形勢(shì)較為嚴(yán)峻。DM患者并發(fā)潰瘍、創(chuàng)傷后創(chuàng)面難以愈合，致殘率極高，給患者身體及心理帶來(lái)極大痛苦[15，16]。DM患者皮膚創(chuàng)傷難以愈合的原因較為復(fù)雜。國(guó)內(nèi)外眾多研究顯示，DM造成創(chuàng)傷難愈合的主要原因?yàn)椋孩貲M會(huì)引起患者體內(nèi)糖代謝功能障礙，造成體內(nèi)糖基化物質(zhì)濃度上升，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，造成表皮細(xì)胞凋亡[17]；②DM患者多伴發(fā)神經(jīng)性病變，導(dǎo)致機(jī)體促表皮愈合神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)受阻，造成人體正常對(duì)損傷自修復(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制運(yùn)轉(zhuǎn)滯后，干擾正常的組織及皮膚自然性愈合[18]；③DM可致患者生長(zhǎng)因子受體異變及濃度下降，阻礙表皮細(xì)胞及皮下組織、肌肉組織細(xì)胞DNA合成[19]，干擾正常構(gòu)成新人體組織細(xì)胞的增殖，減慢新組織添補(bǔ)創(chuàng)傷口[20]；④多數(shù)DM患者因病變及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入量不足，自身免疫功能下降，故對(duì)侵入細(xì)菌抵抗力不足，可致創(chuàng)傷口感染，促使傷口膿化，進(jìn)一步干擾表皮細(xì)胞更新增殖；⑤DM患者血運(yùn)能力下降，造成表皮創(chuàng)傷口血液流量降低，造成創(chuàng)傷壞死。針對(duì)這些原因，有研究提出在促DM患者創(chuàng)傷愈合過(guò)程中，利用人體自然促表皮細(xì)胞增殖因子使得創(chuàng)面上皮化功能正常發(fā)揮，提高愈合效果，同時(shí)已有研究證明[21]，DM大鼠表皮組織ESCs數(shù)量少、活性低。因此，我們認(rèn)為ESCs結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的功能下降可能是導(dǎo)致DM患者創(chuàng)面難愈的一個(gè)重要因素。

有研究顯示[22]，β-catenin是一種調(diào)節(jié)表皮ESCs分化的重要因子，促進(jìn)機(jī)體對(duì)創(chuàng)傷進(jìn)行自然性修復(fù)，其通過(guò)和上表皮組織內(nèi)ESCs內(nèi)鈣黏蛋白結(jié)合[23]，促進(jìn)細(xì)胞間黏合及和外基質(zhì)鏈接，保證表皮結(jié)構(gòu)完整性，激活Wnt通路[24]，而Wnt-1和表皮組織生成、生長(zhǎng)及愈合具有密切關(guān)系[25]。同時(shí)，β-catenin還可激活其下游靶基因CyclinD1，提高其表達(dá)水平，其可加快表皮細(xì)胞生長(zhǎng)周期進(jìn)階速度，細(xì)胞增殖及分化關(guān)系較密切，加快表皮自修復(fù)進(jìn)程。K6蛋白作為一種人體內(nèi)促細(xì)胞增殖的角蛋白，其和細(xì)胞增殖關(guān)系較密切，有研究認(rèn)為K6濃度水平與表皮細(xì)胞過(guò)度增殖具有顯著的正相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，觀察組DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6陽(yáng)性表達(dá)率和陽(yáng)性染色I(xiàn)A均低于對(duì)照組，說(shuō)明DM大鼠表皮組織ESCs中β-catenin、CyclinD1、Wnt-1、K6表達(dá)降低。筆者推測(cè)這可能是導(dǎo)致DM大鼠表皮組織ESCs功能下降的原因。

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