廣東地區人群MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性與非綜合征性唇腭裂發病的關系

蘭菲菲，丁紅珂，陳延冰，杜麗，尹愛華

(廣東省婦幼保健院，廣州 511442)

廣東地區人群MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性與非綜合征性唇腭裂發病的關系

蘭菲菲，丁紅珂，陳延冰，杜麗，尹愛華

(廣東省婦幼保健院，廣州511442)

目的探討MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性與廣東人群非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)發病的相關性。方法收集162例廣東地區NSCL/P患者為病例組，178例廣東地區健康對照者為對照組，用TaqMan探針和實時熒光定量PCR法檢測兩組受檢者MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性，并比較兩組等位基因和基因型分布。結果病例組和對照組的基因型、等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡。病例組等位基因T頻數169(52.16%)、等位基因C頻數155(47.84%)，對照組分別為227(63.76%)、129(36.24%)。兩組等位基因頻率比較，P<0.05。病例組基因型TT者50例(30.86%)、TC者69例(42.59%)、CC者43例(26.54%)，對照組分別為71例(39.89%)、85例(47.75%)、22例(12.36%)，兩組基因型分布相比P<0.05。結論MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性與廣東地區NSCL/P發病相關。

非綜合征性唇腭裂； MAFB基因；rs13041247位點；單核苷酸多態性；廣東省

非綜合征性唇腭裂(NSCL/P)，是指不伴發其它系統器官畸形的單純性唇裂、腭裂、唇裂合并腭裂的總稱，是新生兒常見的先天性頜面部畸形之一。其群體發病率約1‰～2‰ ,不同國家發病率相差較大。國外發病率約為0.6‰～1.69‰。我國是NSCL/P的高發國家，發病率約為1.82‰[1]，占出生缺陷的14.01%[2]，僅次于神經管畸形的發生率，在出生嚴重畸形的發生中占第二位。廣東省的唇腭裂發病率約為1.26‰[3]，居各種缺陷的首位或僅次于胎兒水腫綜合征。NSCL/P病因尚不明確，是一種復雜的多因素疾病，涉及遺傳、環境及兩者的相互作用，有一定的種族和地區差異，男女比例大約為2∶1[4]，其病因學研究是目前出生缺陷研究中的焦點問題之一。NSCL/P是多基因遺傳病，由遺傳和環境因素相互作用引起[5]，遺傳學因素在唇腭裂的發病中起重要的作用。有關NSCL/P易感基因的篩選、定位和研究方法是研究的熱點和難點。近年來，全基因組關聯分析(GWAS)方法發現了一些新的NSCL/P易感基因[6～10]，MAFB基因是其中之一[11]。但是MAFB基因如何在NSCL/P發病過程中發揮作用尚不清楚。本研究觀察了廣東地區NSCL/P患者MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性變化，探討MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性與廣東地區NSCL/P的相關性。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2015年12月廣東省婦幼保健院收治的162例NSCL/P患者為病例組，患者出生地均為廣東，其中男82例、女80例，年齡1～20歲，明確排除綜合征性唇腭裂(SCL/P)。另選同期查體的178例健康人為對照組，其中男90例、女88例，年齡1～20歲。兩組受檢者性別、年齡相比P均>0.05。本研究已獲我院醫學倫理委員會批準，兩組受檢者或其監護人均已簽署知情同意書并填寫調查問卷。

1.2 MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性檢測方法 采集兩組受檢者EDTA-K2抗凝靜脈外周血2 mL，用Lab-Aid核酸DNA分離試劑盒和Lab-Aid820自動核酸提取儀(廈門致善生物科技有限公司)提取基因組DNA。用NanoDrop2000 分光光度計(Thermo Scientific 公司)檢測DNA的濃度與純度后，存放于-80 ℃生物樣品庫保存。

用TaqMan 單核苷酸多態性檢測技術進行等位基因檢測和基因型分型。MAFB基因rs13041247位點的TaqMan探針由上海生工生物公司合成，探針上游序列5′-TCCTGGCTGCGTCACTTA-3′，下游序列5′-TCCTGGCTGTGTCACTTA-3′。PCR擴增引物上游序列5′-CCTGGGTTTGTATTCTTC-3′，下游序列5′-GCTCTATCCCAATGTATGT-3′。用96孔板進行PCR擴增反應，反應總體積20 μL，包含Premix Ex Taq (Probe qPCR) 10 μL、上下游引物各0.4 μL、TaqMan探針各0.8 μL、Rox reference Dye 0.4 μL、DNA 模板1 μL、去離子水6.2 μL。用7500 Fast Real-Time PCR system(美國ABI公司)行實時熒光定量PCR，擴增條件為：60 ℃ 1 min；95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，55 ℃ 20s，65 ℃ 50 s，共40個循環；60 ℃ 1 min。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件。先對兩組基因型和等位基因分布進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，如果兩組基因型和等位基因分布符合Hardy-Weinberg平衡則采用χ2檢驗比較兩組兩組基因型和等位基因分布的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

經過Hardy-Weinberg 平衡檢驗，病例組和對照組的基因型、等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡。病例組等位基因T頻數169(52.16%)、等位基因C頻數155(47.84%)，對照組分別為227(63.76%)、129(36.24%)。兩組等位基因頻率比較，P<0.05。病例組基因型TT者50例(30.86%)、TC者69例(42.59%)、CC者43例(26.54%)，對照組分別為71例(39.89%)、85例(47.75%)、22例(12.36%)，兩組基因型分布相比P<0.05。

3 討論

唇腭裂是人類最常見的面部先天性畸形，分為綜合征性唇腭裂(SCL/P)和NSCL/P，發病率高。NSCL/P的發病機制比較復雜，至今仍未完全明確[12]。唇腭裂不僅嚴重影響面部美觀，還因為口與鼻腔相通影響患者發育，常導致上呼吸道感染，并發中耳炎，患者吮奶困難，嚴重的唇腭裂患者不能正常哺乳，導致明顯營養不良。唇腭裂患者在生長發育期間說話時吐字不清，影響語言發育，給兒童和家長的心理造成嚴重的創傷。又因其治療程序復雜、周期漫長、花費大，給家庭和社會帶來沉重負擔，嚴重影響出生人口素質。因此，唇腭裂的病因和預防的研究非常重要。

MAFB基因位于20q12，編碼亮氨酸拉鏈轉錄因子[13，14]。動物實驗研究發現MAFB基因可能參與鼠的顱面外胚層發育。研究發現MAFB基因在胚胎小鼠顎板的上皮細胞表達較高，推測MAFB基因可能參與了鼠的顎板發育，所以其單核苷酸多態性可能與NSCL /P有關。有學者在2011年報道的研究中發現，華南漢族人群中MAFB基因SNP位點rs6072081、rs17820943 和rs6102085，以及IRF6基因的單核苷酸多態性位點rs10863790與NSCL/P的發病有顯著關聯。Yuan等[15]在拉丁美洲人群的GWAS 研究中發現MAFB基因的rs11696257和rs13041247位點與NSCL/P相關。rs13041247位點在MAFB基因的下游區，其錯義突變可能影響了蛋白結構功能[11]。2015年Sun等[16]通過GWAS方法研究發現MAFB基因的rs13041247位點與NSCL/P相關。以上研究結果均表明MAFB基因是NSCL/P的易感基因[15]，MAFB基因的單核苷酸多態性位點與NSCL/P發病存在很強的相關性。本研究選取的病例組和對照組均為廣東地區人群，基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，研究群體具有代表性。對病例組與對照組MAFB基因rs13041247位點等位基因和基因型分布進行比較發現，兩組MAFB基因rs13041247位點等位基因和基因型分布差異有統計學意義，與Moreno等[12]和Sun等[16]的研究結果相符，進一步證實了MAFB基因rs13041247位點單核苷酸多態性與廣東地區NSCL /P發病相關。本研究僅選擇了已報道的、通過GWAS分析的有意義的單核苷酸多態位點。如果將來條件允許，可以進一步擴大樣本量，或將MAFB基因相關多個單核苷酸多態位點與環境因素納入進行連鎖分析，同時進行家系分析研究，可以更好地探究MAFB基因SNP位點在NSCL/P發病機制中所起的作用。

[1] 肖坤則,張芝燕,李金春，等.中國唇腭裂的流行病學[J].中華醫學雜志,1989,69(4):192.

[2] Hofstee Y, Kors N, Hennekam RC. Genetic survey of a group of children with clefting: implications for genetic counseling [J]. Cleft Palat Craniofac J, 1993,30(5):447-451.

[3] 鄧煜,連志浩.唇腭裂流行病學研究[J].中華口腔雜志,1991,26(6) :386.

[4] 黃洪章.唇腭裂病因學研究的新進展[J].口腔頜面外科雜志,2007,17(3):201-204.

[5] Michael JD, Mary LM, Terri HB, et al. Cleft lip and palate: synthesizing genetic and environmental influences[J]. Nat Rev Genet, 2011,12(3):167-178.

[6] Zucchero TM, Cooper ME, Maher BS, et al. Interferon regulatory factor 6 (IRF6) gene variants and the risk of isolated cleft lip or palate[J]. N Eng J Med, 2004,351(8):769-780.

[7] Birnbaum S, Ludwig KU, Reutter H, et al. Key susceptibility locus for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate on chromosome 8q24[J]. Nat Genet, 2009,41(4):473-477.

[8] Mangold E, Ludwig KU, Birnbaum S, et al. Genome-wide association study identifies two susceptibility loci for nonsyndromic cleft lip with or without cleft palate[J]. Nat Genet, 2010,42(1):24-26.

[9] Alkuraya FS, Saadi I, Lund JJ, et al. SUMO1 haplo insufficiency leads to cleft lip and palate[J]. Science, 2006,313(5794):1751.

[10] Mangold E, Ludwig KU, Nothen MM. Breakthroughs in the genetics of orofacial clefting[J]. Trends Mol Med, 2011,17(12):725-733.

[11] Beaty TH, Murray JC, Marazita ML, et al. A genome-wide association study of cleft lip with and without cleft palate identifies risk variants near MAFB and ABCA4[J]. Nat Genet, 2010,42(6):525-529.

[12] Moreno LM, Arcos-Burgos M, Marazita ML, et al. Genetic analysis of candidate loci in non-syndromdic cleft lip families from Antioquia-Colombia and Ohio [J]. Am J Med Genet, 2004,125(2):135-144.

[13] Gemelli C, Montanari M, Tenedini E, et al. Virally mediated MafB transduction induces the monocyte commitment of human CD34 hematopoietic stem/progenitor cells[J]. Cell Death Differ, 2006, 13(19):1686-1696.

[14] Van Stralen E, van de Wetering M, Agnelli L, et al. Identi?cation of primary MAFB target genes in multiplemyeloma[J]. Exp Hematol, 2009,37(2):78-86.

[15] Yuan Q, Blanton SH, Hecht JT. Association of ABCA4 and MAFB with non-syndromic cleft lip with or without cleft palate[J]. Am J Med Genet A, 2011,155(6):1469-1471.

[16] Sun Y, Huang Y, Yin A, et al. Genome-wide association study identifies a new susceptibility locus for cleft lip with or without a cleft palate[J]. Nat Commun, 2015,6(4):6414.

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.35.018

R722.11

B

1002-266X(2017)35-0055-03

2017-05-18)

廣東省醫學科研基金項目(B2014021)。

尹愛華(Email: yinaiwa@vip.126.com)