ABAT基因多態性對癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度的影響

張貴萍，楊冰竹，李磊，趙靜，潘煥，張云梅

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

ABAT基因多態性對癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度的影響

張貴萍，楊冰竹，李磊，趙靜，潘煥，張云梅

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

目的觀察ABAT基因多態性對癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度的影響。方法收集癲癇患兒80例，單用丙戊酸鈉10～30 mg/kg治療5個半衰期(約100 h)后達到穩態；取外周靜脈血，采用熒光偏振免疫法測定丙戊酸鈉血藥濃度，用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性計數分析ABAT(rs1731017、rs1641022)基因多態性，比較不同基因型對丙戊酸鈉血藥濃度的影響，用多元線性回歸分析影響丙戊酸鈉血藥濃度的因素。結果80例患者中，ABAT rs1731017位點AA、GG、GA基因型分別為23、23、34例，ABAT rs1641022位點CC、AA、CA基因型分別為11、27、42例。血藥濃度為(48.15±20.99)μg/mL，其中ABAT rs1731017位點AA基因型為(36.41±20.12 )μg/mL，低于GG基因型患兒的(53.26±22.99)μg/mL(P<0.05)，ABAT rs1641022各基因型患兒血藥濃度均無統計學意義(P均>0.05)。多元線性回歸分析顯示，患兒體質量及ABAT rs1731017A/G多態性是影響丙戊酸鈉血藥濃度的獨立因素。結論ABAT rs1731017基因多態性對丙戊酸鈉的血藥濃度存在影響，對AA基因型癲癇患兒可適當增加藥物的劑量。

癲癇；丙戊酸鈉；ABAT基因；基因多態性；血藥濃度;兒童

癲癇是臨床上常見的神經系統慢性疾病，我國癲癇發病率約為0.7%，其中60%于小兒時期起病[1]。丙戊酸鈉(VPA)是一線傳統抗癲癇藥之一，其對全面性癲癇的失神發作、肌陣攣和強直-陣攣發作都有一定療效；但是，丙戊酸鈉有治療指數低、安全范圍窄、療效個體差異大等缺點，此外遺傳因素也對其代謝及藥效有明顯影響。丙戊酸鈉是一種代謝途徑及作用機制非常復雜的藥物，涉及到多種代謝途徑。目前研究比較多的是Ⅰ相細胞色素P450酶(CYP450)的代謝和Ⅱ相尿苷酸二磷酸葡萄糖醛酸酶(UGT)的羧化作用[2，3]。研究[4]發現，丙戊酸鈉能提高抑制神經遞質γ氨基丁酸(GABA)水平從而發揮抗癲癇作用，其主要途徑是通過抑制γ氨基丁酸轉氨酶(GABAT)活性。ABAT基因是GABAT的編碼基因，存在rs1731017A/G、rs1641022C/A突變[5]。為此，本研究應用多聚酶鏈反應(PCR)對170例丙戊酸鈉單藥治療的癲癇患兒ABAT基因多態性進行分析，評估ABAT基因多態性對丙戊酸鈉代謝的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年8月～2014年8月遵義醫學院附屬醫院門診的癲癇病患兒80例，男40例、女40例，年齡(4.16±1.85)歲，體質量(9.96±3.98)kg，均經詢問臨床癥狀、神經系統體格檢查、腦電圖、頭部CT/MRI檢查后確診為癲癇，每年發作頻率超過2次。排除就診前有使用其他抗癲癇藥物者，肝腎功能異常者，有結構性或進行性腦部疾病者，合并其他遺傳代謝疾病者，資料不全、依從性差者。本研究所有患兒或其監護人均簽署知情同意書，并取得醫院倫理委員會的批準。

1.2 丙戊酸鈉服用方法及血藥濃度監測 單藥服用丙戊酸鈉糖漿(德巴金，杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司)，日劑量為10～30(15.52±5.58)mg/kg。患兒在服藥后經5個半衰期(約100 h)后達到穩態，于清晨空腹服藥前采血4 mL，將一半血液置于普通試管中用于丙戊酸鈉血藥濃度的測定。應用西門子血藥濃度檢測儀采用熒光偏振免疫法(FPIA)測定丙戊酸鈉血藥濃度，每份標本測2次，取其平均值。為消除患兒體質量和服藥劑量對血藥濃度的偏差，將檢測的血藥濃度除以患兒每日每公斤體質量的服藥量得到患兒的標準血藥濃度。

1.3 ABAT rs1731017、rs1641022基因多態性分析 將血液標本的另外一半置于EDTA抗凝試管中4 ℃保存，在2 h內用DNA提取試劑盒(美國Omega公司)完成DNA樣本提取，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性(PCR-RFLP)技術檢測 ABAT rs1731017、rs16410222位點的多態性。采取Primer5.0軟件設計引物序列，ABAT rs1731017上游引物為5′-TATGATGGGCCTCTGATGAAG-3′、下游引物為 5′-CTAAGCTTGGCTGTGCCTTTG-3′，rs16410222上游引物為 5′-CTCCCACGGGTGTTTATTTCT-3′、下游引物為5′-GCTCCAACTCACAGCATTAGG-3′，由上海生工公司合成。PCR反應體系：DNA模板60 ng，上下游引物濃度均為0.2 μmol/L，dNTPs濃度為200 μmol/L，1×buffer及1 U TaqDNA聚合酶，加入去DNA酶水至25 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；4 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，35個循環；72 ℃ 5 min。擴增結束后，擴增產物由3%瓊脂糖凝膠電泳定性。ABAT基因型判斷標準：rs1731017A/G、rs1641022C/A相應產物分別經AvaⅠ和RsaⅠ內切酶(大連寶生物公司)37 ℃水浴過夜，用3%瓊脂糖凝膠電泳分離，根據分離片段長度判斷基因型。ABAT rs1731017 基因型AA(126 bp)、AG(126、46、80 bp)、GG(46、80 bp)，ABAT rs1641022 基因型AA(224 bp)、AC(224、150、74 bp)、CC(150、74 bp)。

2 結果

2.1 癲癇患兒ABAT rs1731017、rs1641022基因多態性檢測結果 ABAT rs1731017位點AA基因型23例(28.75%)、GG基因型23例(28.75%)、GA基因型34例(42.50%)，ABAT rs1641022C位點CC基因型11例(13.75%)、AA基因型27例(33.75%)、CA基因型42例(52.50%)。

2.2 癲癇患兒血藥濃度檢測結果 80例癲癇患兒血藥濃度為(48.15±20.99)μg/mL，其中ABAT rs1731017位點AA、GG、GA基因型分別為(36.41±20.12 )、(53.26±22.99)、(47.94±18.99)μg/mL，ABAT rs1641022位點CC、AA、CA基因型分別為(43.69±18.78)、(51.15±22.83)、(49.15±21.24)μg/mL。ABAT rs1731017位點AA基因型患兒血藥濃度低于GG型患兒(P<0.05)，其余同位點不同基因型間兩兩比較均無統計學差異。

2.3 癲癇患兒ABAT rs1731017、rs1641022基因多態性與血藥濃度的關系 通過多元線性回歸分析患者性別、年齡、體質量、日劑量、ABAT rs1641022C/A多態性、ABAT rs1731017A/G多態性對丙戊酸鈉血藥濃度的影響，僅有患者體質量(Sb= 0.008，bi=0.837，P=0.000)及ABAT rs1731017A/G多態性(Sb=0.045，bi=-0.136，P=0.038)2個因素納入回歸方差。回歸方程為丙戊酸鈉血藥濃度(μg/mL)=0.629+0.110×體質量(kg)-0.095×ABAT rs1731017A/G(AA=1、GG=2、GA=3)。

3 討論

丙戊酸鈉是一種廣譜抗癲癇藥，廣泛應用于癲癇的治療中，尤其適用于全面性癲癇，常作為一線抗癲癇藥物使用；但是，在臨床使用過程中存在療效差異性大的缺點。兒童患者肝腎功能尚未完全發育，比成年人更容易出現藥物不良反應。丙戊酸鈉的不良反應往往與其血藥濃度有著密切的關系。丙戊酸鈉血藥濃度的影響因素比較多，患兒的遺傳因素、生理特征、病理因素及患兒的服藥依從性是導致血藥濃度變化的重要因素[6，7]。本研究通過多元線性回歸發現，患兒的體質量及ABAT rs1731017A/G多態性都會對血藥濃度產生影響。

研究[8]發現，體質量低于10 kg者丙戊酸鈉血藥濃度與劑量低度相關，而體質量大于30 kg則二者存在中度相關，說明體質量與血藥濃度存在密切的關系。本研究也得到了類似的結論。其原因可能是體質量越小的低齡兒童代謝旺盛，其藥物清除速率越快，血藥濃度就越低。因此，對于年齡小、體質量低者應該適當增加單位劑量以獲得更穩定的血藥濃度水平，保證抗癲癇治療效果；而體質量偏大者則應選擇偏小的單位劑量，保證療效的同時避免產生藥物不良反應。

丙戊酸鈉在體內主要有三種代謝途徑，其中40%是通過線粒體β氧化。各種代謝途徑均涉及到多條藥理通路，多種受體和通道參與其中，如鈉離子通道基因、組蛋白乙酰轉移酶抑制劑、ABAT基因、鈣離子T型阻滯劑的CACNA1I、CACNA1H等等[11]。 因此，編碼這些酶和受體的基因突變都會引起丙戊酸鈉的代謝發生變化，從而使得患者在療效上存在巨大差異。 ABAT基因位于16號染色體的13區2帶，其主要功能是編碼GABAT參與GABA的分解代謝[9]。當GABAT不足時，就會引起GABA含量升高，出現神經精神興奮性的癥狀，如難治性的癲癇發作和腦電圖的異常。Barnby等[10]研究發現，ABAT基因表達水平與GABAT的活性存在一定的關聯。當ABAT基因發生多態性改變時，會導致GABAT水平發生改變，從而導致GABA含量發生改變，從而影響丙戊酸鈉的代謝及臨床療效。

此外，ABAT還能促進二磷酸脫氧核糖核苷轉化為三磷酸脫氧核糖核苷，這樣能夠維持線粒體膜的功能和線粒體呼吸鏈復合物的活性[12]。本研究結果發現，ABAT rs1641022中等位基因C的頻率是28.75%、等位基因A的頻率是66.25%，ABAT rs1731017A/G中等位基因G頻率是50.00%、等位基因A的頻率是50.00%，此結果與其他學者研究結果類似[5]。本研究顯示，ABAT rs1731017A/G(Gln/Arg)中AA型攜帶者比GG型攜帶者標準化的丙戊酸鈉血藥濃度顯著降低。其原因可能是由于基因的突變，導致其編碼的氨基酸發生改變。谷氨酸(Glu)是中樞神經系統中最主要的興奮性神經遞質，腦內Glu水平增高與癲癇有著密切的關系。有研究[13]證實，丙戊酸鈉通過調節星形膠質細胞的Glu釋放水平從而控制Glu能神經元的活性，達到治療癲癇的作用。本研究發現，ABAT rs1731017A/G由于基因的突變，導致其編碼Gln的含量不同。Gln是神經元合成Glu的原料，從而導致丙戊酸鈉血藥濃度的改變。因此認為，ABAT的多態性與兒童癲癇患者丙戊酸鈉的代謝有密切關系，是影響患兒丙戊酸鈉血藥濃度及臨床療效的一個重要因素。但是本組也存在一定的局限之處：首先樣本量較小，可以擬擴大樣本量進行進一步研究；另外，癲癇是一種多基因共同影響的疾病，受到多條通路多個基因的調控，而且環境因素也會對療效產生一定的影響。因此，ABAT基因多態性對癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度的影響尚需進一步研究證實。

[1] Reynolds EH. ILAE/IBE/WHO Global Campaign “out of the shadows”: global and regional developments[J]. Epilepsia, 2001,42(8):1094-1100.

[2] Chen LC, Chou MH, Lin MF, et al. Lack of pharmacokinetic interaction between valproic acid and a traditional Chinese medicine, Paeoniae Radix, in healthy volunteers[J]. J Clin Pharm Ther, 2000,25(6):453-459.

[3] Otoul C, Smedt HD, Stockis A. Lack of pharmacokinetic interaction of levetiracetam on carbamazepine, valproic acid, topiramate, and lamotrigine in children with epilepsy[J]. Epilepsia, 2007,48(11):2111-2115.

[4] Lebon V, Petersen KF, Cline GW, et al. Astroglial contribution to brain energy metabolism in humans revealed by13C nuclear magnetic resonance spectroscopy: elucidation of the dominant Pathway for neurotransmitter glutamate repletion and measurement of astrocytic oxidative metabolism[J]. J Neurosci, 2002,22(5):1523.

[5] Zhang B, Yuan Y, Jia Y, et al. An association study between polymorphisms in five genes in glutamate and GABA pathway and paranoid schizophrenia[J]. Eur Psychiatry, 2005,20(1):45-49.

[6] 周金玉,王奎興,孫增先.影響丙戊酸鈉血藥濃度波動的因素及應對措施[J].中國藥房,2003,14(6):353-354.

[7] 崔建敏.淺析影響丙戊酸鈉血藥濃度的因素[J].中國現代藥物應用,2010,4(17):138-139.

[8] 江志,張潔,陳波,等.癲癇患兒丙戊酸鈉血藥濃度影響因素間交互作用的研究[J].中國全科醫學,2012,15(7):755-758.

[9] 趙光杰.ABAT基因在人類疾病中的研究進展[J].復旦學報醫學版,2016,43(3):357-361.

[10] Barnby G, Abbott A, Sykes N, et al. Candidate-gene screening and association analysis at the autism-susceptibility locus on chromosome 16p: evidence of association at GRIN2A and ABAT[J]. Am J Hum Genet, 2005,76(6):950-966.

[11]Haerian BS, Lim KS, Mohamed EH, et al. Lack of association of ABCB1 haplotypes on five loci with response to treatment in epilepsy[J]. Seizure, 2011,20(7):546-553.

[12] Besse A, Wu P,Bruni F, et al. The GABA transaminase, ABAT, is essential for mitochondrial nucleoside metabolism[J]. Cell Metabolism, 2015,21(3):417-427.

[13] 高楊,雷林生,吳曙光.丙戊酸鈉慢性作用及停藥后對C6神經膠質瘤細胞GAT-3及GABA-T mRNA表達的影響[J].南方醫科大學學報,2003,23(9):885-887.

本刊2017年57卷第30期104～107頁文章《尿源性干細胞在醫學實驗研究中的應用進展》中，基金項目為江蘇高校品牌專業建設工程一期項目(PPZY2015B161)，通信作者為陳鳳鴻(E-mail: 254279976@qq.com )。特此聲明。

本刊編輯部

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.021

R725.9

B

1002-266X(2017)34-0065-03

2017-03-24)