慢性乙型肝炎干擾素治療與KIR基因多態性及干擾素抗體的相關性研究

王慧　林棟棟　李長纓　柳富會

【摘要】 目的：為觀察KIR基因對干擾素療效的作用及其與干擾素抗體產生的相關性，將慢性乙型肝炎干擾素治療的患者進行KIR基因多態性、血清干擾素抗體進行綜合分析。方法：隨機選取應用干擾素治療的慢乙肝患者60例，檢測KIR基因分型、相關生化免疫指標及HBV-DNA載量以及干擾素抗體。根據研究對象對干擾素的治療情況，將其分為治療有效組和治療無效組，將兩組患者的KIR分型結果進行統計學處理；另外根據是否產生干擾素抗體，將研究對象分為抗體生成組和非抗體生成組，并分別對KIR分型的結果及其療效進行統計學處理，分析兩組KIR分型的差異性及對干擾素治療效果的影響。結果：（1）在60例研究對象中共檢出17種KIR基因的24個等位基因，其中假基因3DP、框架基因2DL4、3DL2、3DL3在兩組研究對象中出現的頻率為100%，KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5等位基因在干擾素治療有效組表達頻率明顯高于治療無效組，KIR2DS4*003-007等位基因在治療有效組頻率明顯低于治療無效組，差異均有統計學意義（P<0.05），其他等位基因分布比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（2）60例研究對象治療后血清抗-干擾素抗體陽性者有8例（13.33%），其中包括治療有效組6例（20.00%），治療無效組2例（6.67%），差異無統計學意義（P=0.254）。（3）2DL5B*002/004/007、3DL1*001-009/015-020及3DP1*003與干擾素抗體的產生均有相關性（P<0.05）。結論：（1）可能同慢乙肝患者干擾素應答有關的KIR基因有：KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5，可能同干擾素治療無效有關的KIR基因為KIR2DS4*003-007。（2）抗干擾素抗體對干擾素療效影響較小，且陽性率較低。（3）KIR基因型中可能與抗-干擾素抗體產生有關的包括：2DL5B*002/004/007、3DL1*001-009/015-020及3DP1*003。

【關鍵詞】 慢性乙型肝炎； KIR基因； 殺傷細胞免疫球蛋白樣受體； 干擾素抗體

Study on the Correlation between KIR Gene Polymorphism and Interferon Antibody in Patients with Chronic Hepatitis B/WANG Hui，LIN Dong-dong，LI Chang-ying，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（06）：020-024

【Abstract】 Objective：In order to observe the effect of KIR gene on the therapeutic effect of interferon and its correlation with the production of interferon antibody，to analyze the KIR gene polymorphism and serum interferon antibody.Method：60 cases of chronic HBV infection were randomly selected，and the KIR genotype was detected，the interferon antibody，the HBV-DNA carrier rate and the related immunological indexes and biochemical tests were performed.According to the response to interferon therapy，the test objects were divided into effective treatment group and ineffective treatment group，two groups of KIR typing results were analyzed；the other according to interferon antibody production or not，the test objects were divided into antibody group and non antibody group，and the type of KIR effect and the results of the two groups were statistically differences，analysis of the impact of the antibody on the efficacy of two groups and KIR typing results.Result：（1）In 60 subjects were detected in the 17 KIR genes and 24 alleles，including false gene 3DP，gene 2DL4，3DL2 framework and 3DL3 in two groups of subjects in the frequency was 100%，the KIR2DL2*001-005，2DS2*001-005，3DP1*001/002/004，2DL5 allele in treatment effective group were significantly higher than those in ineffective treatment group，the frequency of KIR2DS4*003-007 allele in the effective treatment group was significantly lower than that in ineffective treatment group，the differences were statistically significant（P<0.05），there was no significant difference in the distribution of other alleles（P>0.05）.（2）60 patients with after treatment，there were 8 cases（13.33%）with positive anti interferon antibody，including the treatment of effective group of 6 cases（20.00%），2 cases in ineffective treatment group，the difference was not statistically significant（P=0.254）.（3）2DL5B*002/004/007，3DL1*001-009/015-020 and 3DP1*003 were correlated with the production of interferon antibody （P<0.05）.Conclusion：（1）KIR genes may associated with the response to interferon in patients with chronic hepatitis B：KIR2DL2*001-005，2DS2*001-005，3DP1*001/002/004，2DL5，KIR may be associated with interferon therapy ineffective：KIR2DS4*003-007.（2）Anti interferon antibody has little effect on interferon， and the positive rate is low.（3）KIR genotype may be related to anti interferon antibody production：2DL5B*002/004/007， 3DL1*001-009/015-020 and 3DP1*003.

【Key words】 Chronic hepatitis B； KIR gene； Killer cell immunoglobulin like receptor； Interferon antibody

First-authors address：Qingdao NO.6 Peoples Hospital，Qingdao 266033，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.06.006

慢性乙型肝炎在我國為嚴重的病毒性傳染病，發病率居高不下，目前對此類患者的治療主要是抗病毒藥物的治療，其藥物包括干擾素及核苷（酸）類物[1]，慢乙肝患者對抗病毒治療的效果不一，原因除病毒方面影響外，宿主的種族、遺傳因素及免疫狀況均對其產生較大影響[2-5]。目前研究發現慢乙肝患者對干擾素的不同應答水平是與其個體的遺傳因素特別是人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相關基因及其他一些重要基因多態性有關[6]。KIR與HLA有著密切的關聯[7]，本研究目的在于探尋可能同干擾素治療相關的KIR基因，對臨床治療和預后判斷具有一定意義。另外干擾素抗體是否對干擾素治療效果有影響，且抗體的產生是否與機體自身的免疫基因有內在關系，目前尚無結論。本研究擬綜合分析慢乙肝干擾素治療的患者KIR基因多態性、血清干擾素抗體之間的關系，可根據患者的基因特點，合理化、個體化用藥，因此該研究結果具有重要的理論和實踐意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究中的60例患者均為在青島市傳染病醫院就診的接受干擾素治療的慢性乙型肝炎患者。入選標準：60例患者診斷均明確，符合2000年西安會議制定的《病毒性肝炎診斷標準》[8]，并排除其他嗜肝病毒感染、自免肝、藥物性肝炎及核苷類抗病毒藥物使用史者。（1）根據干擾素療效將入選患者分為兩組，干擾素治療有效組（n=30）：HBV-DNA病毒載量較前下降≥2 log；肝功恢復正常；HBeAg滴度下降，部分患者出現HBeAb。干擾素治療無效組（n=30）：HBV-DNA病毒載量較前下降<2 log或未下降；肝功未能恢復正常；HBeAg滴度未下降或未陰轉。（2）根據干擾素抗體產生與否將入選患者分為兩組，干擾素抗體生成組：經干擾素治療后血清抗-干擾素抗體陽性者。干擾素抗體未生成組：經干擾素治療后血清抗-干擾素抗體陰性者。該研究已經倫理學委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 標本的采集 采集研究對象外周靜脈血，清晨空腹，肘靜脈穿刺，抽取外周靜脈全血5 mL，應用EDTA抗凝及血清3 mL，-70 ℃保存備用。

1.3 研究方法

1.3.1 基因組DNA的提取 采用美國戴諾生物有限公司提供的試劑盒，按說明書進行測定。

1.3.2 檢測KIR基因型 應用序列特異性PCR（sequence specific primer polymerase chain reaction，PCR/SSP），采用序列特異性引物聚合酶鏈反應法（SSP-PCR）。應用KIR基因分型試劑盒（DYNAL公司，批號：003），分別檢測KIR2DL1*-5*；2DS1*-5*；3DL1*-3*；3DS1*；2DP1*；3DP1*等位基因。按照說明書進行擴增程序。

1.3.3 干擾素抗體的檢測 采用人干擾素抗體（anti-IFN）酶聯免疫檢測試劑盒（美國R&D公司）測定樣品中是否產生人干擾素抗體。

1.3.4 肝功能的檢測 所用試劑盒由上海科華東菱診斷用品有限公司生產，應用OLYMPUS AU400全自動生化分析儀檢測。

1.3.5 乙肝病毒的相關檢測 HBV標志物（HBsAg、HBsAb、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）：應用上海實業科華生物技術有限公司生產的乙肝五項酶免疫試劑盒，按試劑盒說明書進行操作。HBV-DNA：應用light cycler PCR儀（美國羅氏公司生產），HBV核酸擴增（PCR）熒光定量檢測試劑盒（深圳市匹基生物工程股份有限公司生產）按照說明書所檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件對所得數據進行統計分析，計數資料以率（%）表示，采用四格表 字2檢驗及相關性分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組KIR等位基因的分布情況比較 在本研究中，對60例研究對象共檢測了包括17種KIR基因的24個等位基因，其中框架基因2DL4、3DL2、3DL3及假基因3DP1在所有研究對象中均被檢測到。在干擾素治療有效組檢測到所有KIR等位基因型別。但是在干擾素治療無效組中未檢測到KIR2DL5B*002/004/007、2DL5B*003、3DP1*001-004、3DP1*001/002/004；而可檢測到KIR2DP1*00101-00102、2DL1*001-006、2DL3*001-006、3DP1*003為陽性。干擾素有效組KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5等位基因的陽性率分別為20.00%、20.00%、20.00%、56.67%，均高于干擾素治療無效組的1.11%、0、0、30.07%，差異均有統計學意義（P=0.035、0.024、0.024、0.037），KIR2DS4*003-007等位基因的陽性率為36.67%，較干擾素治療無效組的63.33%明顯降低，差異有統計學意義（P=0.039）；兩組的其他KIR基因位點檢測頻率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 活化性及抑制性KIR基因分布 所有研究對象中，抑制性基因的檢出率均高于或等于相應的活化性基因的檢出率。KIR2DL1、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、3DL1的檢出率分別高于或等于相應的KIR2DS1、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DS1的檢測率。

2.3 干擾素抗體產生與干擾素治療效果的關系 治療后60例患者中抗-干擾素抗體陽性為8例，其中治療有效組為6例（20.00%），治療無效組為

2.4 干擾素抗體與KIR基因型之間的關系 2DL5B*002/004/007、3DL1*001-009/015-020及3DP1*003與干擾素抗體的產生均有相關性（P<0.05），其余KIR基因型與干擾素抗體產生均無關（P>0.05），見表3。

3 討論

3.1 慢性乙型肝炎的抗病毒治療 目前對于慢性乙型肝炎最根本的治療方法為抗病毒治療，抗病毒治療特點為：難治性、可治性、長期性，抗乙肝的藥物包括核苷（酸）類似物及干擾素。其中應用干擾素治療是慢性乙型肝炎患者重要的治療手段，其治療方式為免疫調節和抗病毒雙重作用同時來抑制乙肝病毒的復制。干擾素治療效果與患者感染時的免疫狀態關系密切，適合應用干擾素的指征為：HBeAg陽性，肝功能異常ALT水平在ULN 2.5～10倍，但干擾素治療慢性乙型肝炎持續免疫應答率仍較低。其影響因素較多，目前研究認為影響因素包括：乙肝病毒的基因型多態性[2-3]、遺傳因素特別是HLA相關基因[4]及環境因素等，以及它們之間的相互作用[9-12]，KIR同HLA密切相關，不同患者KIR基因的差異性及多態性研究可以得到與干擾素治療效果相關的基因，并可對慢乙肝患者的干擾素治療及預后判斷有一定意義。

3.2 KIR與臨床疾病的相關研究 目前在疾病相關性研究方面，主要涉及自身免疫性疾病，腫瘤以及某些病毒感染性疾病如HIV、CMV等。奚敏等[13]在CHB干擾素治療效果與HLA-等位基因的關系研究發現，HLA-DRB1*04同干擾素-α治療無應答呈正相關，而HLA-DQA1*0505、HLA-DQB1*0301與其呈負相關。Lu等[14]對中國濟南地區漢族人群研究發現，KIR2DS2和KIR2DS3可能是乙型肝炎的易感基因，引起肝組織的損傷。KIR2DS1、KIR3DS1和KIR2DL5可能有助于機體清除乙肝病毒。然而目前在國內，尚未有研究KIR與干擾素應答水平關系的。

在本次試驗中共研究了24個KIR等位基因在CHB干擾素治療有效組與無效組的分布，其中干擾素治療有效組的KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5等位基因的陽性率均顯著高于干擾素治療無效組（P<0.05），而KIR2DS4003-007等位基因在干擾素治療無效組的表達頻率高于干擾素治療有效組（P<0.05）。這提示KIR2DL2*001-005、2DS2*001-005、3DP1*001/002/004、2DL5等位基因可能是CHB干擾素治療效果的預測因素，KIR2DS4003-007等位基因則可能是CHB干擾素無效的預測因素，這與李長纓等[15]對青島地區漢人的研究結論相同。

3.3 干擾素抗體的相關研究

3.3.1 干擾素抗體與病毒性肝炎 目前對于干擾素抗體與慢性乙型肝炎患者應用干擾素治療的效果之間有無關系尚無定論。毛乾國等[16]研究指出，干擾素具有一定的免疫原性，能刺激機體產生抗體，表明α-干擾素治療慢性乙型肝炎時，干擾素中和抗體的產生能明顯減輕患者干擾素的療效。熊玉卿等[17]在研究中發現慢性HBV感染患者在應用干擾素治療后，未產生干擾素抗體的患者肝功能能很快恢復正常，而產生干擾素抗體的患者肝功能好轉不明顯，兩者差異有統計學意義（P<0.05）。Lok等[18]的研究表明，干擾素中和抗體的產生可導致患者應用干擾素治療時的HBV-DNA的陰轉率明顯下降。

Craxi等[19]則認為干擾素抗體產生與否并未影響干擾素的抗病毒活性。劉國珍等[20]研究證明，干擾素的免疫原性較弱，應用干擾素治療后機體產生干擾素抗體的機率較低，即使產生抗體，其水平也較低。這些研究表明干擾素在慢性乙型肝炎治療中仍是重要有效的藥物。

本研究60例慢性乙型肝炎患者在經過干擾素治療后，產生干擾素抗體的為8例，表明其陽性率低。其中干擾素治療有效組6例（20.00%），干擾素治療無效組2例（6.67%），差異無統計學意義（P=0.254），提示抗干擾素抗體陽性對干擾素治療療效影響較小。

3.3.2 干擾素抗體與KIR基因型之間的關系 目前對于干擾素抗體與KIR基因型關系的相關研究甚少，本研究表明2DL5B*002/004/007、3DL1*001-009/015-020及3DP1*003與干擾素抗體的產生均有相關性（P<0.05），提示這些基因可能同干擾素抗體的產生可能有影響。

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（收稿日期：2016-10-12） （本文編輯：張爽）