紅景天苷的提取、純化及其合成研究進展

許玲玲+楊曉東++盛柳青+陳菲+李群力

[摘要] 紅景天苷是紅景天的主要有效成分，具有多種藥理作用，紅景天苷的研究已成為熱點。目前，出現(xiàn)新技術或方法用于紅景天苷的提取、分離與合成，如用閃式提取法、酶解法和超高壓提取法提取紅景天苷；用雙水相萃取技術和溶劑浮選法純化紅景天苷；用酶催化合成法合成紅景天苷等。本文對近十年來有關提取、純化及其合成紅景天苷的研究進行歸納總結，為紅景天苷的深入研究提供依據(jù)。

[關鍵詞] 紅景天苷；提取；合成；研究進展

[中圖分類號] R914 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）02（c）-0053-04

紅景天苷具有抗疲勞、抗缺氧、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、增強免疫、改善心血管系統(tǒng)等作用[1]，還能提高記憶力和學習能力，雙向調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等[2]。

目前，國內(nèi)外獲取紅景天苷的方法有3種：從植物中提取純化紅景天苷、通過合成制備紅景天苷以及通過生物轉(zhuǎn)化或生物催化合成。本文對近十年來有關提取、純化及其合成紅景天苷的各種方法進行綜述。

1 紅景天苷的提取

紅景天、女貞子[3]、藏藥甘青烏頭[4]等多種植物都含有紅景天苷。因其易溶于水、甲醇和乙醇中，因此多用這些溶劑提取紅景天苷。

1.1 回流提取法

回流提取法是常用的提取方法，操作簡單，有利于企業(yè)大生產(chǎn)。曾慶華等[5]經(jīng)研究證實可用水做溶劑提取出紅景天苷。陳小明等[6]研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷的提取率隨提取溶劑乙醇的濃度增加而增加，但當乙醇濃度達60%后，提取率不再升高。蒲忠慧等[7]也通過均勻設計得出乙醇濃度為60%時，紅景天苷得率很高。但回流提取法存在能耗大、耗時等問題。

1.2 高壓或超高壓提取法

超高壓提取法能耗低、提取效率高，可在常溫下進行，能有效避免活性成分受熱分解。程子毓等[8]采用高壓提取罐通過密閉升溫產(chǎn)生的高壓提取紅景天苷。陳健等[9]研究出超高壓提取最佳條件為：紅景天加入73.3%乙醇，液固比29.5∶1（mL∶g），壓力達255.5 MPa，提取2 min，紅景天苷的提取率為9.29 mg/g，明顯高于回流提取、超聲提取和微波提取法。超高壓比高壓壓力更大，提取效率更高，但若用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，大型超高壓儀器設備尚需做深入研究。

1.3 閃式提取法

閃式提取法是將物料快速破碎至適當粒度，提取時間短，可避免有效成分受熱被破壞。范桂強等[10]通過研究得到優(yōu)化工藝條件：紅景天加入95%乙醇，料液比20∶1（mL∶g），閃式提取40 s，電壓140 V，提取2次，紅景天苷的提取率明顯高于回流提取法和超聲提取法。需要注意的是如果使用不當，不僅達不到提取效果還會損壞提取設備。

1.4 酶解法

纖維素酶能夠分解破壞植物細胞破壁的纖維素骨架，有利于細胞內(nèi)有效成分的溶出與釋放。董彥莉等[11]研究發(fā)現(xiàn)最佳酶解工藝為：纖維素酶用量為紅景天的2.0%，用醋酸鈉/醋酸緩沖液調(diào)節(jié)提取液pH值至5.4，酶解溫度為50℃，酶解110 min。酶解法有提取條件溫和、提取率高等優(yōu)點，但存在酶的活性不穩(wěn)定、耗時等問題。

1.5 微波提取法

微波提取法具有快速、高效等特點。辛云霞等[12]研究表明，微波提取女貞子中紅景天苷的工藝條件為，加入30%乙醇，液固比為20 mL/g，提取溫度為45℃ ，微波提取2 min，功率為600 W，紅景天苷的提取率為0.9113%。范明輝等[13]研究發(fā)現(xiàn)，與采用傳統(tǒng)乙醇加熱回流120 min提取4次的結果相比，微波輔助提取1 min提取兩次的結果相差不大，說明微波提取法省時快捷，但微波對人體有輻射，不利于勞動保護。

1.6 超聲提取法

超聲提取法具有提取效率高、節(jié)能等優(yōu)點。何寶佳等[14]研究發(fā)現(xiàn)不同溶劑提取紅景天苷的提取率從高到低的順序為：60%乙醇>90%乙醇>甲醇>30%乙醇>水提。楊志紅等[15]通過研究得出最佳工藝是：紅景天加入80%乙醇，料液比1∶6，超聲波功率375 W，提取10 min。提取率較乙醇回流提取法高，并且提取溫度低、時間短。王興芳等[16]通過比較發(fā)現(xiàn)，索氏提取法提取紅景天中紅景天苷的提取率最高，但耗時最長；乙醇回流提取法提取率低，提取液含的雜質(zhì)較多；超聲提取法提取率較高，但噪音比較大。

1.7 多種技術聯(lián)用提取

曾慶華等[17]先用超聲波提取，再微波提取大花紅景天中的紅景天苷。王丹等[18]先用超臨界CO2流體萃取紅景天，得到殘渣，再用微波輔助提取殘渣中的紅景天苷。只是他們尚未系統(tǒng)比較聯(lián)用技術和單一技術提取紅景天苷孰優(yōu)孰劣。

2 紅景天苷的純化

2.1 柱色譜法

通常采用大孔吸附樹脂、硅膠柱、高速逆流色譜或制備高效液相等對紅景天苷進行純化。大孔吸附樹脂對紅景天苷吸附量大，還可以再生，適合大生產(chǎn)。王聰慶等[19]從21種樹脂篩選出對紅景天苷吸附率和解吸率高的LSA-30型大孔樹脂，10%和30%乙醇可洗脫下來大量紅景天苷。閔建華等[20]從8種大孔吸附樹脂篩選出SP-825型，乙醇濃度達10%時，洗脫率達最大值，乙醇濃度過高會把較多色素等雜質(zhì)一并沖洗下來，過低則有效成分未能充分解吸附。戴傳云等[21]研究表明，與大孔吸附樹脂相比，硅膠柱分離效果更好，制得的紅景天苷純度達95%以上，但使用了有毒溶劑氯仿和甲醇。傅春燕等[22]研究制備型高效液相色譜純化女貞子中紅景天苷，在18 min的運行時間內(nèi)，紅景天苷與干擾成分得到很好的分離，紅景天苷純度達到98%以上。李遠等[23]利用高速逆流色譜來純化紅景天苷，當溶劑為氯仿∶甲醇∶水=4∶1.5∶2時，紅景天苷的純度為84.3%。高速逆流色譜和制備型高效液相具有快速高效、分離組分純度高等優(yōu)點，可用于制備高純度的紅景天苷。

2.2 膜分離技術

膜分離技術可在常溫下操作，具有工藝簡便、污染輕等特點。張麗娟[24]采用截留相對分子質(zhì)量10 000的膜材料PS分離紅景天苷，紅景天苷的含量由超濾前的4.20%提高到超濾后的15.58%。李光達等[25]利用LG蛋白絮凝劑和無機陶瓷膜過濾對紅景天提取液進行純化研究，發(fā)現(xiàn)除雜效果很好，解決了傳統(tǒng)水提醇沉法得到的藥液滅菌后出現(xiàn)析出物的問題。膜分離法雖然有高效、節(jié)能等優(yōu)點，但膜在反復使用時，膜通量會逐漸下降，需要反復清洗。

2.3 雙水相萃取技術

雙水相萃取技術是一種新型液-液萃取技術，具有條件溫和、設備操作簡單、易于大生產(chǎn)等優(yōu)點，可用于純化活性成分。郭青峰[26]用質(zhì)量分數(shù)為24%的PEG 1000與16%的（NH4）2SO4組成的雙水相體系，外加1% KCL，萃取紅景天提取液（0.14 mg/mL）中的紅景天苷，在室溫下萃取2 h，紅景天苷萃取率為96%。雙水相萃取法回收率高、能耗小，但是選擇穩(wěn)定的雙水相體系需要深入探索。

2.4 溶劑浮選法

溶劑浮選法具有分離與富集同時完成的特點。慶易微等[27]利用紅景天苷的疏水親氣性純化紅景天苷，水相中的紅景天苷可被大量氣泡所產(chǎn)生的“氣-液”界面吸附，并隨氣泡上升至上層，待氣泡破裂后溶解于上層有機相中，收集有機相。他研究出最佳浮選條件： 正丁醇作為浮選溶劑，試液pH為4，氮氣流速為50～60 mL/min，浮選30 min，測得紅景天苷的浮選效率為67.23%。說明溶劑浮選法分離效果好。

3 紅景天苷的化學合成

3.1 主要以葡萄糖為原料合成

郭建峰等[28]把葡萄糖經(jīng)異丁酰基和三氟乙酰基保護羥基，隨后與4-苯甲酰氧基苯乙醇發(fā)生糖苷化反應，最后在堿性條件下脫保護得紅景天苷，純度達99.5%，總收率約55%。該工藝減少了雜質(zhì)的生成，反應速度快、選擇性好，但繁瑣。

3.2 主要以對羥基苯甲醛或?qū)αu基苯乙酸為原料合成

張翼軒等[29]以對羥基苯甲醛為原料，先經(jīng)酚羥基保護，再經(jīng)醛基還原、氯代、氰化、水解、酯化和還原反應，制得4-芐氧基苯乙醇，再與溴代四乙酰基葡萄糖偶聯(lián)后，脫保護基合成紅景天苷，總收率為12.8%。鄧梅等[30]以對羥基苯乙酸為原料，先對羥基進行乙酰化保護，再用硼氫化鈉還原，然后與溴代四乙酰葡萄糖縮合，同時脫保護得到紅景天苷，純度為87.5%，總收率63%。此兩種工藝反應條件溫和，操作簡單易行，但反應路線較長。

3.3 主要以對氨基苯乙醇或?qū)αu基苯乙醇為原料合成

許大艷等[31]以對氨基苯乙醇為原料，先經(jīng)重氮化，水解，再與芐氯反應，然后與溴代四乙酰基葡萄糖反應，最后催化脫芐基得紅景天苷，總收率達66%～70%。郭建鋒等[32]以對羥基苯乙醇和葡萄糖為原料，經(jīng)保護基保護、糖苷化反應后，在堿性條件下脫保護得到紅景天苷，收率為56.49%，純度達99.5%以上。Liang等[33]和徐利鋒等[34]都是以對羥基苯乙醇和五-O-乙酰基β-D-葡萄糖為原料，前者將原料在路易斯酸催化劑作用下反應，然后在堿性條件下脫酰基，測得紅景天苷的總產(chǎn)率為47%；后者將原料經(jīng)無水氯化錫催化的糖苷化，脫保護制得紅景天苷，純度達98.5%以上，產(chǎn)率為46.2%。該合成方法的優(yōu)勢在于不需保護對羥基苯乙醇中酚羥基，直接進行糖苷化生成糖苷。

可以看出，以對羥基苯乙醇為主要原料的合成路線較短，污染少，原料易得，成本較低，紅景天苷純度高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

4 紅景天苷的生物合成與生物催化合成

4.1 植物組織培養(yǎng)合成紅景天苷

紅景天苷的苷元來自酪氨酸，而酪氨酸與苯丙氨酸均來自莽草酸途徑。2-氨基磷酸茚是苯丙氨酸解氨酶的特異性抑制劑。茉莉酸甲酯可顯著提高次生代謝過程中關鍵基因的表達水平。王逸文等[35]通過研究表明，2-氨基磷酸茚和茉莉酸甲酯可顯著提高高山紅景天愈傷組織中紅景天苷含量，但它們濃度過高會對愈傷組織的生長有抑制作用。李陽等[36]研究發(fā)現(xiàn)高山紅景天愈傷組織培養(yǎng)20 d后，加入225 μmol/L的茉莉酸甲酯，再繼續(xù)培養(yǎng)4 d，紅景天苷和多糖的含量及其產(chǎn)量最高，明顯高于野生植株。

轉(zhuǎn)基因西洋參冠癭組織具有遺傳性狀穩(wěn)定、激素自養(yǎng)、增殖速度快等優(yōu)點，與植物懸浮細胞相比，它具有更強的次生代謝物合成能力。楊麗等[37]發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基有利于西洋參冠癭組織的生長及紅景天苷的生物合成。蔗糖作為碳源的效果最明顯，添加外源物質(zhì)肌醇和VB6，可顯著提高紅景天苷的轉(zhuǎn)化率。

4.2 細胞培養(yǎng)合成紅景天苷

細胞培養(yǎng)技術對自然資源的保護，特別是對保護瀕危植物具有重大的意義。艾江寧等[38]研究發(fā)現(xiàn)高山紅景天細胞內(nèi)紅景天苷的合成和生長曲線密切相關，屬于生長偶聯(lián)型。在植物細胞培養(yǎng)體系中適當添加在生物合成途徑中與目標產(chǎn)物距離更為接近的前體物質(zhì)，能提高次生代謝產(chǎn)物的含量積累。魏欣方等[39]在高山紅景天懸浮細胞培養(yǎng)起始期，分別添加適量的前體物苯丙氨酸、肉桂酸和酪氨酸，它們均能促進細胞內(nèi)紅景天苷的生物合成。由于培養(yǎng)細胞中葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的活性易受到細胞生長階段和環(huán)境因素影響，培養(yǎng)液中積累的酪醇并未完全有效地轉(zhuǎn)化為紅景天苷。故利用植物細胞培養(yǎng)進行生物轉(zhuǎn)化合成紅景天苷有一定的局限性。

4.3 酶催化合成紅景天苷

合成紅景天苷關鍵一步就是酪醇與葡萄糖脫水形成糖苷鍵，可通過生物酶法催化合成紅景天苷。何麗妃等[40]選擇疏水性離子液體（C4MIm·PF6）、1，4-二氧六環(huán)和乙酸乙酯、檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液組成反應體系，采用交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體直接催化糖基化反應合成紅景天苷，能明顯提高紅景天苷的濃度，酶經(jīng)多批次反應仍有較高活性。

紅景天苷合成酶能夠催化底物酪醇和葡萄糖合成紅景天苷，可通過提高底物酪醇的含量，增加紅景天苷產(chǎn)量。高雪華等[41]用黑曲霉發(fā)酵的方法獲得酪醇合成酶和紅景天苷合成酶的粗提物，通過酶催化可在短期間內(nèi)將紅景天苷和酪醇的含量提高139.9%和191%。

5 結語

對各種提取方法進行比較，回流提取法和酶解法很適合企業(yè)大生產(chǎn)，但它們比較耗時。超高壓提取、閃式提取、微波提取和超聲提取法有提取率高、時間短，能耗低等優(yōu)點，但它們對提取設備都有很高的要求，這在一定程度上阻礙了它們在工業(yè)化生產(chǎn)中的應用。

對有關優(yōu)化提取工藝的試驗設計進行分析，在單因素實驗的基礎上，研究人員很少使用簡單的正交實驗或均勻正交設計，而是用復雜的實驗設計如均勻Box-Behnken中心組合試驗、星點設計、徑向基函數(shù)（RBF）人工神經(jīng)網(wǎng)絡模型等結合響應面分析法優(yōu)化工藝，這些方法使結果更準確、合理。

對獲取紅景天苷的方法進行比較，提取法、化學合成法和生物合成法各有優(yōu)缺點。由于紅景天苷在植物中含量很低，從植物中提取紅景天苷，雖然操作簡單，對環(huán)境污染較少，但提取率低，純度不高，需要進一步純化；化學合成法具有收率和純度都很高、反應快速、成本低等優(yōu)點，但大多合成路線需要對基團進行選擇性保護或使用昂貴的金屬催化劑，所用的一些催化劑和試劑易污染環(huán)境；生物合成與催化合成具有反應條件溫和，過程簡單、選擇性高等特點，但存在酶的活性和穩(wěn)定性差、效價低、耗時、成本高等問題。

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（收稿日期：2016-11-08 本文編輯：李岳澤）