小鼠CD45-/CD31+肺側群細胞誘導分化的研究*

張明杰，李宗澤，徐楊，梁迅

（錦州醫科大學 生物化學與分子生物學教研室，遼寧 錦州 121000）

小鼠CD45-/CD31+肺側群細胞誘導分化的研究*

張明杰，李宗澤，徐楊，梁迅

（錦州醫科大學 生物化學與分子生物學教研室，遼寧 錦州 121000）

目的探討在體外誘導分化肺側群細胞（SP）的特性。方法 取小鼠肺組織，流式細胞術分選小鼠白細胞分化抗原（CD）45-/CD31+肺SP；免疫熒光檢測分選肺SP三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2（ABCG2）的表達；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測肺SP中ABCG2、酪氨酸激酶2（Tie2）及血管性血友病因子（vWF）的表達。細胞體外分化誘導14d后，免疫熒光檢測細胞vWF的表達；RT-PCR檢測分化誘導前后細胞中ABCG2和vWF的表達。結果 流式細胞術成功分選出CD45-/CD31+肺SP細胞，免疫熒光檢測其表達ABCG2；RT-PCR檢測SP表達ABCG2和Tie2，不表達vWF。主群細胞表達vWF；分化誘導前的肺SP表達ABCG2；分化誘導后的肺SP表達vWF。結論 CD45-/CD31+肺SP是血管內皮細胞的祖細胞，具有干細胞分化特性。在體外培養可分化為血管內皮細胞。

側群細胞；血管內皮細胞；三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2

肺疾病是引起死亡的主要原因[1-3]。肺移植并不是5年死亡率＜50%的萬靈藥[4]，因此迫切需要新方法。側群細胞（side population cells，SP）是利用Hoechst染料和流式細胞儀進行造血干細胞分離時發現的特殊細胞。白細胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）45+為血液細胞標記，CD45-為肺細胞標記，CD31+為內皮細胞標記，CD31-為間充質細胞標記。以往的研究對CD45+和CD31-已做報道，但未報道CD45-/CD31+[5-7]。本實驗收集小鼠肺，流式細胞術分選出CD45-/CD31+側群細胞，體外誘導培養，探討其是內皮細胞的祖細胞，可以在體外發育成內皮細胞，為臨床治療肺疾病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 內皮培養基（endothelial cell growth medium-2，EGM-2），購自美國 Cambrex公司，Methocult GF M3534購自加拿大STEMCELL Technologies公司，Tryspin購自美國Sigma公司，膠原酶、分散酶購自上海吉凱基因化學技術有限公司，RNA提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，cDNA逆轉錄試劑盒購自美國ABI公司，逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RTPCR）試劑盒購自美國Promega公司，抗體購自英國Abcam公司，Hoechst33342、DAPI、胰蛋白酶、維拉帕米及碘化丙啶（propidium iodide，PI）儀購自美國Sigma公司。

1.1.2 實驗儀器 二氧化碳CO2孵箱購自美國Sheldon Manufacturing Inc公司，流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司，超凈工作臺購自新加坡ESCO公司，酶標儀購自德國BMG公司，離心機購自德國Het-tich公司，聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀購自美國Thermo Scientifics公司。

1.1.3 實驗動物 實驗小鼠來自遼寧省錦州醫科大學動物實驗中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 收集細胞 取小鼠肺組織用刀片攪碎，在37℃、0.1%膠原酶、2.4 u/ml分散酶和2.5 mmol CaCl2條件下孵育1 h，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate belanced solution，PBS）懸浮、過濾，收集細胞[8]。

1.2.2 流式細胞術分選CD45-/CD31+小鼠肺側群細胞及檢測 取收集的細胞計數，將細胞數量調整為1×106個/ml濃度，重懸細胞于培養液中。實驗組加入終質量濃度為5 mg/L的熒光染料Hoechst33342；對照組加入終質量濃度為5 mg/L的熒光染料Hoechst 33342及終質量濃度為100 mg/L的維拉帕米。37℃避光水浴90min，每隔20min輕微震蕩1次。90min后終止染色，用冷的PBS洗滌，4℃、1 000r/min離心5 min，去上清液，用冷的PBS重懸。加入終質量濃度為 2 mg/L的 PI，上流式細胞儀分選，Hoechst33342的激發光為375 nm。流式細胞儀分別收集側群細胞與主群細胞。用CD44和干細胞抗原1 （stem cell antigen 1，Sca1）抗體檢測其表達情況[9]。

1.2.3 免疫熒光染色檢測三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）蛋白表達 將玻片放在流式細胞儀特定位置收集細胞。丙酮固定幾秒（-20℃），PBS漂洗3次，2 min/次。0.5%Txiton X-100處理20 min，PBS漂洗3次，2 min/次。血清封閉20 min，PBS漂洗3次，2 min/次。滴加一抗，37℃孵育2 h，PBS漂洗3次，2min/次。滴加二抗，37℃孵育30min，PBS漂洗3次，2 min/次。加入4'，6-二脒基 -2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5min，PBS漂洗3次，2min/次。熒光顯微鏡觀察并拍照。

表1PCR引物序列

1.2.4 RT-PCR檢測ABCG2、血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）及酪氨酸激酶2（tyrosine kinase，Tie2）基因的表達 收集的細胞用冷的PBS漂洗2次，12 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入350 μl裂解緩沖液，充分裂解。加入1ml Trizol，冰上勻漿。轉入新的1.5 ml離心管，室溫保存5 min。加0.2 ml氯仿，震蕩混勻，室溫放置5 min。4℃、10 000 r/min離心15 min，將上層吸到一個新的1.5 ml離心管，按照試劑盒說明書提取RNA。按照試劑盒說明書將其逆轉錄成cDNA。按照試劑盒說明書進行PCR反應，反應條件為：95℃預變性3 min，95℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環，72℃繼續延伸10 min。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。見表1。

1.2.5 細胞克隆形成實驗及流式細胞術檢測其是否為CD45-/CD31+小鼠肺側群細胞 用Methocult GF M3534 media培養基連續培養CD45-/CD31+小鼠肺側群細胞14 d，用流式細胞儀檢測。

1.2.6 細胞體外分化誘導及免疫熒光檢測vWF表達和RT-PCR檢測ABCG2的表達 將流式細胞儀分選的細胞用EGM-2培養基在37℃、5%CO2條件下，連續培養14 d。14 d后，取一部分培養的細胞應用免疫熒光技術檢測ABCG2的表達，再取一部分培養的細胞（14 d）和新分選的細胞（0 d）通過RT-PCR反應檢測兩者ABCG2和vWF的表達，方法同1.2.4。通過Image Pro Plus 6.0軟件進行分析，測其積分光密度值，以各條帶值與內參條帶值之比為目的基因的相對表達量。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 分選的CD45-/CD31+小鼠肺側群細胞

分離的收集的細胞經過流式分選后，側群細胞位于左下角兩種熒光均很弱的區域。實驗組低染區側群細胞比例為0.4%，對照組低染區側群細胞比例＜0.4%，被維拉帕米阻滯，證實從小鼠肺組織收集的細胞中確實存在側群細胞。進一步分選出CD45-/CD31+肺側群細胞，所占比例為22%。CD分化群44及Sca1檢測結果呈現CD44陰性，Sca1陽性。見圖1。

2.2 ABCG2蛋白的表達

分選的CD45-/CD31+肺側群細胞進行免疫熒光染色，觀察到細胞表達ABCG2蛋白。見圖2。

2.3 ABCG2、vWF及Tie2基因的表達

RT-PCR檢測基因表達，結果呈現肝臟特異性脂蛋白（liver specific lipoprotein，LSP） 高表達ABCG2，肺主群細胞（lung main population，LMP）不表達ABCG2。LSP表達的ABCG2相對含量與LMP比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=58.441，P= 0.000）。LMP高表達vWF，LSP不表達vWF，LSP表達的vWF相對含量與LMP比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-12.291，P=0.000）。Tie2在LSP與LMP中均表達，LSP表達的Tie2相對含量與LMP比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-95.905，P= 0.000）；Tie2是內皮細胞的標記，提示LSP可能是內皮細胞的祖細胞。見表2和圖3。

圖1 分選的小鼠CD45-/CD31+肺側群細胞

2.4 CD45-/CD31+小鼠肺側群細胞的檢測結果

分選的CD45-/CD31+肺側群細胞克隆形成實驗后，結果呈現LSP大量增殖并呈現聚集生長狀態，流式技術結果呈現Sca1陽性，其仍然是CD45-/CD31+小鼠肺側群細胞。見圖4、5。

2.5 vWF和ABCG2的表達

細胞體外分化誘導，免疫熒光檢測結果呈現有ABCG2的表達；RT-PCR檢測結果呈現誘導前的LSP表達ABCG2，誘導后的LSP不表達ABCG2，誘導前LSP表達的ABCG2相對含量與誘導后比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=62.682，P=0.000）。誘導后的LSP表達vWF，誘導前的LSP不表達vWF，誘導前的LSP表達的vWF相對含量與誘導后比較，經t檢驗，差異有統計學意義（t=-19.503，P=0.000）；說明CD45-/CD31+小鼠肺側群細胞分化成血管內皮細胞。見圖6、7和表3。

圖2ABCG2蛋白的表達 （×40）

表2CD45-/CD31+肺SP與肺MP的ABCG2、vWF及Tie2相對表達量比較 （n=8，±s）

表2CD45-/CD31+肺SP與肺MP的ABCG2、vWF及Tie2相對表達量比較 （n=8，±s）

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圖3ABCG2、vWF及Tie2的表達

圖4 CD45-/CD31+小鼠肺側群細胞克隆形成

圖5 流式細胞儀檢測CD45-/CD31+

圖6vWF的表達 （×40）

圖7ABCG2和vWF的表達

表3 誘導前后側群細胞ABCG2、vWF的相對表達量比較（n=8，±s）

表3 誘導前后側群細胞ABCG2、vWF的相對表達量比較（n=8，±s）

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3 討論

近年來，對側群細胞的研究和應用都取得很大進展，側群細胞由于分布廣泛，含量豐富，又有明確的表型標記和分離純化方法，所以可以用于基因治療、生物醫學研究、生長發育過程研究等領域。側群細胞可以通過不對稱分裂產生大量與自己相同的子代細胞，同時也能分化成具有有限分化能力的后代。MOSERLE等[10]發現，肝癌細胞株Hep3B、MHCC97-L、MHCC97-H及HCCLM3所含的側群細胞比例分別為0.9%、4.2%、14.5%和28.7%，所得高純度的側群細胞在體外培養后，這4種細胞株始終能保持一定的側群細胞比例，說明側群細胞具有自我更新的功能，這有助于維持穩定的細胞儲備。新的研究表明，側群細胞及腫瘤干細胞驅動和維持人類腫瘤的多種類型[11]。側群細胞在動物模型中能夠產生腫瘤，非側群細胞則不能[12]，從腫瘤干細胞中分離側群細胞，進而研究側群細胞的特性[13]。側群細胞的克隆形成和侵襲能力明顯高于非側群細胞，該特征進一步表明側群細胞的其他屬性[14]。同時，對肺側群細胞進行研究，對肺損傷及肺部疾病的治療有非常重要的意義，對腫瘤的防治和干細胞生物學的發展有深遠的影響[15]。

肺是呼吸系統的一部分，功能是進行氣體交換，良好的肺功能是維持生命的保障。胸外科角度上肺是胸腔內最大的臟器，也是胸外科中病變種類和發病數量最多的器官。常見的肺部疾病有氣胸、肺大泡、肺氣腫和肺癌，肺源性心臟病、呼吸衰竭、肺栓塞、肺膿腫、肺炎、新生兒肺炎、小兒肺炎、氣管炎、哮喘、肺結核、塵肺、間質性肺疾病、呼吸系統疾病等。肺部疾病比較常見，而且發起病來后果嚴重，甚至危及生命，例如慢性肺源性心臟病，是由于肺組織、肺動脈的原發性病變，使肺血管阻力增加，肺動脈壓力升高，從而造成右心負荷加重，右心室肥大，最終導致右心功能衰竭，繼而危及生命[16]。研究肺側群細胞分化為血管內皮細胞，可以為由于肺損傷及肺疾病等引起的細胞損傷提供新的細胞，從而延緩病情。

本實驗分選小鼠CD45-/CD31+肺側群細胞，通過體外誘導分化培養，最終分化發育為血管內皮細胞。實驗結果表明，CD45-/CD31+肺側群細胞是血管內皮細胞的祖細胞，具有干細胞分化特性。這為臨床干細胞的來源獲取提供新途徑，并且為干細胞的研究及肺部疾病的治療研究提供新的思路。

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（童穎丹 編輯）

Differentiation of mouse CD45-/CD31+lung side population cells into endothelial cellsin vitro*

Ming-jie Zhang,Zong-ze Li,Yang Xu,Xun Liang
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Jinzhou Medical University, Jinzhou,Liaoning 121000,China)

ObjectiveTo investigate the characteristics of differentiation of lung side population(LSP)cells in vitro.Methods Mouse lung tissue was taken,and mouse CD45-/CD31+LSP cells were sorted by flow cytometry.Immunofluorescence was used to detect the expression of ATP-binding cassette sub-family G member 2 (ABCG2)in the isolated LSP cells.RT-PCR was applied to detect the expression ofABCG2,Tie2andvWF in mouse CD45-/CD31+LSP cells.After the LSP cells were cultured for 14 days,the expression ofvWFwas detected by immunofluorescence,and the mRNA expression ofABCG2as well asvWFof both freshly isolated LSP cells and cultured LSP cells were examined by RT-PCR.Results Flow cytometry sorted out the CD45-/CD31+LSP cells,and immunofluorescence tested that they expressedABCG2.RT-PCR results revealed that LSP cells expressedABCG2as well asSMAandTie2,but did not expressvWF.LMP highly expressed vWF.The CD45-/CD31+LSP cells expressedABCG2,but did not expressvWFbefore induction of differentiation;while the cells expressedvWFin stead ofABCG2after the induction of differentiation.Conclusions CD45-/CD31+LSP cells might be the progenitor cells of vascular endothelial cells,which possess the characteristics of stem cell differentiation,and can be differentiated into vascular endothelial cellsin vitro.

side population cell;endothelial cell;ATP-binding cassette sub-family G member 2

R329.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.004

1005-8982（2017）06-0017-06

2016-08-25

國家自然科學基金（No：81370619）

梁迅，E-mail：1161653758@qq.com